石蘭嵐 黃 婷 羅 輯 鐘占瓊夏慶杰 張 曉△ 王廷華

1（成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)實驗技術(shù)中心，成都610041）

2（四川大學(xué) 華西校區(qū)神經(jīng)疾病轉(zhuǎn)化中心，成都610083）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后除了創(chuàng)傷造成的原發(fā)性損傷外，脊髓局部還將發(fā)生一系列繼發(fā)性病理改變，其造成的損害超過原發(fā)性損傷［1］。脊髓神經(jīng)阻滯損傷后再生不良，是繼發(fā)性損傷不斷加重所致，而細胞凋亡是繼發(fā)性損傷細胞死亡的主要方式，大量神經(jīng)元凋亡往往導(dǎo)致神經(jīng)功能永久性喪失［2-4］。目前有很多研究報道，Bcl-2和Bax是調(diào)節(jié)細胞凋亡的主要基因，兩者表達量的多寡直接與細胞凋亡有關(guān)。B細胞淋巴瘤／白血病-2（B-cell lymphoma／leukemia-2，Bcl-2），是主要的抗凋亡基因，它能有效地抑制細胞凋亡，是迄今研究最深入，最廣泛的凋亡調(diào)控基因［5］。Bax即（bcl-2associated X protein），是bcl-2的拮抗基因，兩者都屬于bcl-2基因家族成員，通過編碼相應(yīng)功能蛋白起作用。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后特別是脊髓鈍挫傷后Bcl-2和Bax基因mRNA水平的改變多是使用普通RTPCR來檢測，但是這種方法在只能定性不能定量，且易引起PCR產(chǎn)物的交叉污染［6］。近年來，實時熒光定量PCR的應(yīng)用越來越廣泛，而且它與常規(guī)PCR相比特異性更強、敏感性高，且重復(fù)性好［7］。故本研究采用Real-time PCR實時熒光定量PCR來檢測脊髓鈍挫傷模型大鼠Bcl-2和Bax基因的表達變化，為脊髓損傷機制的進一步研究提供證據(jù)。

1 方法

1．1 實驗動物及分組

健康成年雌性SD大鼠72只，體重180～220g，購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)實驗動物中心，隨機分為假手術(shù)組、損傷6h組、損傷12h組、損傷1d組、損傷3d、損傷5d組、損傷7d組、損傷14d組和損傷28d組，每組8只。

1．2 脊髓鈍挫傷模型制備

1．2．1 麻醉 3．6%水合氯醛（1ml／100g），稱取大鼠體重，根據(jù)體重計算麻藥計量，麻醉途徑為腹腔注射（i，p），記錄麻醉時間，并觀察麻醉效果，待瞳孔反射消失，肌張力減弱及疼痛反射消失，標志麻醉成功。

1．2．2 固定與編號 麻醉成功后，將大鼠以俯臥位姿勢固定于特制手術(shù)臺，根據(jù)實驗計劃進行編號。染色時最好剪掉所涂部位的毛，并沿逆毛方向涂抹染料。

1．2．3 具體方法 在大鼠頸部摸觸到的最高點為第二胸椎棘突，沿脊髓脊柱向后約3～4cm，有一明顯的圓鈍凸起即為第十胸椎棘突，以其為中心進行備皮，并用碘伏消毒備皮區(qū)域。以T10棘突為中心，沿脊髓方向切開皮膚，用止血鉗鈍性分離皮膚與筋膜，在剪開粘膜，用撐開器撐開皮膚與筋膜，暴露出肌肉，再次進行定位T10，然后以T9為中心，手術(shù)刀沿脊柱兩側(cè)剖開椎旁肌，剪斷T8、T9、T10棘突之間的棘間韌帶，以充分暴露T9棘突，沿椎板棘突形狀剔除T9椎旁肌，以充分暴露T9椎板，用鑷子輕輕夾住T8棘突，輕輕提起脊柱，用咬骨鉗咬除T9棘突，從T9和T10椎體之間間隙入手，咬除T9椎板，暴露脊髓。記錄整個剝除椎板時間。

1．2．4 將大鼠放置在自制打擊儀上，把打擊棒一端提起使其與磁力吸引器接觸，按住開關(guān)后，打擊棒被吸在磁力吸引器上，旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)旋鈕，將打擊棒下端與大鼠脊髓水平面處于同一水平面上，按下調(diào)零按鈕，使示數(shù)歸零。再次調(diào)節(jié)旋鈕，將10g中的打擊棒調(diào)節(jié)到高度為30mm處。用碘伏消毒打擊棒下端，松開開關(guān)，打擊棒自由落體，砸傷暴露出的脊髓，可見大鼠后股匍動或是鼠尾擺動。打擊完畢時立即提起打擊棒，并用棉簽止血，記錄打擊時間。清理傷口后，縫合肌肉，筋膜和皮膚，并用碘伏消毒傷口。注射1ml青霉素（2萬單位／只）和2ml葡萄糖。術(shù)后每日排尿和喂食等護理兩次。

1．3 組織總RNA的提取

（1）將組織和TRIZOL裂解液一起轉(zhuǎn)移入5ml勻漿器，勻漿至均勻、不粘、無顆粒后入EP管①。4℃12000r／min離心10min，取上清液入EP管②；

（2）加入200μl氯仿，劇烈振蕩10-15s，室溫靜置15min，4℃12000r／min離心15min，觀分層；

（3）取上清至EP管③，加入500μl異丙醇，振蕩10～15s，-20℃靜置10min，4℃12000r／min離心8min（可見管底有透明的膠狀沉淀）后棄去上清液；

（4）加入1ml預(yù)冷的75%乙醇洗滌RNA，輕輕振蕩幾次后，-20℃儲存。

1．4 Real-Time PCR

各組大鼠麻醉后，取鈍挫傷段脊髓0．3cm用Real-Time PCR檢測Bcl-2和Bax的基因表達量。按說明書將組織裂解提取RNA，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，放入定量PCR儀按兩步法進行PCR擴增。條件如下：94℃2min，94℃20s，50℃～60℃（依據(jù)引物的 Tm 值可變）20s，60℃40s，45cycles；引物序列為：Bcl-2上游引物：GAGGATTGTGGCCTTCTTTG；下游引物：GTTCCACAAAGGCATCCCAG；探針：CCCCTGGTGGACAACATCGC；Bax上游引物：TGGAGCTGCAGAGGATGATT；下游引物：CAGGGCCTTGAGCACCAGTT；探針：CAGACTCCCCCCGAGAGGTC；和β-actin上游引物：GAAGATCAAGATCATTGCTCCT；下游引物：TACTCCTGCTTGCTGATCCA；探針：CTGTCCACCTTCCAGCAGA。最后得到S形動力學(xué)曲線。讀取Ct值，人工校正后按2-ΔCt計算出相對表達量。

1．5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

大鼠脊髓鈍挫傷后Bcl-2和Bax基因表達變化

Real-Time PCR顯示脊髓鈍挫傷后Bax基因表達變化如下，假手術(shù)組Bax水平較高，脊髓鈍挫傷6 h后Bax表達較假手術(shù)組顯著降低（P＜0．01），脊髓鈍挫傷12h及1dBax表達水平相對升高，較6h具有顯著性差異（P＜0．01），鈍挫傷3d及5d其表達水平下降，較1d差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。在鈍挫傷14d恢復(fù)至6h組水平（見圖1）。

圖1 Bax在脊髓鈍挫傷大鼠不同時間點基因相比表達量Fig 1 The relative gene expression of Bax at different time in spinal cord contusion rats

Real-Time PCR顯示脊髓鈍挫傷后Bcl-2基因表達變化如下，假手術(shù)組Bcl-2水平較高，在脊髓鈍挫傷6h顯著下降（與sham組相比，P＜0．01），12h呈現(xiàn)一個上升的趨勢，這時Bcl-2表達水平較6h比有顯著升高（P＜0．01），隨即在頓挫傷1d時Bcl-2水平又下降（與12h比，P＜0．05），持續(xù)至7d，鈍挫傷14d時Bcl-2基因表達水平相對升高，與1d組比有顯著性差異（P＜0．01），28d時其表達仍明顯低于sham 組水平（與sham 組相比，P＜0．01）（見圖2）。

圖2 Bcl-2在脊髓鈍挫傷大鼠不同時間點基因相比表達量Fig 2 The relative gene expression of Bcl-2at different time in spinal cord contusion rats

3 討論

脊髓損傷常導(dǎo)致不同程度的肢體殘障，感覺及運動功能損傷，給患者、家庭和社會帶來極大痛苦及沉重經(jīng)濟負擔，一直是神經(jīng)科學(xué)及骨科學(xué)的一個熱點。但目前脊髓損傷機制尚不清楚，仍無有效的治療措施。近年來的研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，神經(jīng)細胞的凋亡在繼發(fā)性損傷中發(fā)揮重要作用［8］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，在假手術(shù)組，Bax的mRNA水平處于較高的水平，在SCI后6h立即下降，兩組相比差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。12h后Bax較6h有明顯上升，此時Bax mRNA與假手術(shù)組相比雖有升高但差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。1d時，Bax基因表達已恢復(fù)到假手術(shù)組水平。這個結(jié)果提示，在SCI后早期Bax的改變可能不是造成細胞凋亡的主要原因。損傷后3d，Bax基因較1d顯著性下降，這與之前的研究結(jié)果有差異［9］。造成差異的原因可能是損傷后模型不相同及普通RT-PCR與Realtime PCR在檢測基因水平時的敏感性不一。

抗凋亡基因Bcl-2在SCI后整體呈現(xiàn)一個明顯下降的趨勢，這與之前的研究結(jié)果是一致的［10-11］。在假手術(shù)組，Bcl-2mRNA水平較高，在損傷后6h立即下降（P＜0．01），在12h的時候有明顯的上升，這個結(jié)合Bax基因在SCI后的改變，提示在損傷后Bcl-2／Bax的比值改變可能是SCI后調(diào)控細胞凋亡的一個重要因素。Fan等［12］實驗證明bcl-2和bax的表達強度直接或間接影響脊髓神經(jīng)細胞的凋亡，且凋亡程度與其比值相關(guān)。林院等［13］研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2／bax兩蛋白之間的比例，是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關(guān)鍵因素。馬利杰等［14］也通過對bcl-2，bax及其比值的變化與細胞凋亡檢測結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)bcl-2／bax值最小時是細胞凋亡發(fā)生的高峰，并且隨著bcl-2／bax值的增大，凋亡的細胞在逐漸減少。綜上，在SCI后bcl-2和bax的表達對神經(jīng)細胞凋亡的調(diào)控有一定的影響，它們的比值直接關(guān)系到神經(jīng)細胞凋亡發(fā)生的與否。MP是眾所周知的目前對脊髓損傷的治療唯一具有療效的藥物［15］，國外有學(xué)者證實MP療法增強SCI功能恢復(fù)的機制之一為提高Bcl-2表達和抑制Bax表達［16］。鄭世雄等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠急性SCI早期，注射FTY720能夠促進Bcl-2表達，抑制Bax表達，調(diào)高Bcl-2／Bax比值抑制神經(jīng)細胞凋亡，并能減輕脊髓損傷程度，對脊髓神經(jīng)有保護作用。綜上結(jié)果說明，在脊髓損傷后，降低促凋亡基因Bax的表達，提高抗凋亡基因Bcl-2的表達，可以減輕脊髓繼發(fā)性細胞凋亡損傷，從而促進損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。另外，本研究采用的是Real-time PCR的方法來檢測脊髓鈍挫傷后bax和bcl-2基因的表達改變，更為精準地展現(xiàn)了SCI后兩個基因的一個表達變化趨勢，為bax和bcl-2基因在脊髓鈍挫傷后的作用機制的研究提供一定的依據(jù)。

［1］ Lee TT，Green BA．Advances in the management of acute spinal cord injury［J］．Orthop Clin North Am，2002，33（2）：311-315．

［2］ Beattie MS，F(xiàn)arooqui AA，Bresnahan JC．Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury［J］．J Neurotrauma，2000，17（10）：915-925．

［3］ 段有文，呂剛，吳海龍，等．Bcl-2和bax基因和細胞凋亡的關(guān)系及其在脊髓損傷中的作用［J］．中華麻醉學(xué)雜志，2005，10：97．

［4］ Lu J，A shwell KW，Waite P．Advances in secondary spinal cord injury：role of apoptosis［J］．Spine，2000，25（14）：1859-1866．

［5］ Seki T，Hida K，Tada M，et al．Role of the Bcl-2gene after contusive spinal cord injury in mice［J］．Neruosurgery，2003，53（1）：192-198．

［6］ 黃艷萍，王宇明．熒光定量PCR與普通PCR檢測HBV DNA的對照分析［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001，2（8）：992-993．

［7］ Ginzinger DG．Gene quantification using real-time quantitative PCR：an emerging technology hits the mainstream ［J］．Exp Hematol，2002，30（6）：503-512．

［8］ Martin LJ，Liu Z．Injury-induced spinal motor neuron apoptosis is preceded by DNA single-strand Breaks and is p53-and Bax-dependent［J］．J NeuroBiol，2002，50（3）：181-197．

［9］ Amit D．Kandhare V．Shivakumar．Evaluation of the neuroprotective effect of chrysin via modulation of endogenous biomarkers in a rat model of spinal cord injury［J］．J N at Med，2014：68：586-603．

［10］ Kandhare AD，Shivakumar V，Rajmane A，et al．Evaluation of the neuroprotective effect of chrysin via modulation of endogenous biomarkers in a rat model of spinal cord injury［J］．J Nat Med，2014，68（3）：586-603．

［11］ Chen MH，Ren QX，Yang WF，et al．Influences of HIF-Iα on Bax／Bcle-2and VEGF expressions in rats with spinal cord injury［J］．Int J Clin Exp Pathol，2013，6（11）：2312-2322．

［12］ Fan L H，Wang K Z，Cheng B et al．Anti-apoptotic and neuroprotective effects of Tetramethylpyrazin following spinal cord ischemia in rabbits［J］．BMC Neurosci，2006，7：48．

［13］ 林院．Β-干擾素對SD大鼠急性脊髓損傷后Bax、Fas、Bcl-2基因逼到和細胞凋亡的影響［D］．福建醫(yī)科大學(xué)，2010．

［14］ 馬利杰，王紅，王相利，等．大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)細胞Bcl-2與Bax比值及細胞凋亡的關(guān)系［J］．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，26（22）：2042-2045．

［15］ Samantaray S，Smith JA，Das A，et al．Low dose estrogen prevents neuronal degeneration and microglial reactivity in an acute model of spinal cord injury：effect of dosing，route of administration，and therapy delay ［J］．Neurochem Res，2011，36（10）：1809-1816．

［16］ Kim YT，Caldwell JM，Bellamkonda RV．Nanoparticle mediated local delivery of methylprednisolone after spinal cord injury［J］．Biomaterials，2009，30（13）：2582-2590．

［17］ 鄭世雄．FTY720對大鼠急性脊髓損傷后Bax及Bcl-2表達的影響［D］．福建醫(yī)科大學(xué)，2011．