陳 曦 劉 哲 鄧茂林 馮 軾

（成都大學 附屬醫(yī)院消化內科，成都610041）

近年來，免疫熒光染色技術在生物及基礎醫(yī)學的科學研究中運用越來越廣泛，當需要在同一組織／細胞上檢查兩種不同抗原時，則需要進行免疫熒光雙標記染色［1］。順序法免疫熒光雙標記染色因為操作流程復雜、操作時間長等缺點而瀕于淘汰，但實際的科研工作中受實驗經費、條件等限制，常常遇到一抗種屬來源相同無法進行同步法免疫熒光雙標記染色的情況。本研究通過對小鼠結腸組織白細胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）［2］和腸神經膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（Glial cell line-derived neurotro-phic factor，GDNF）特異性受體亞基 GFR-α1（GDNF family receptor-α1，GFR-α1）［3］進行的種屬來源一抗順序法免疫熒光雙標記染色，探討了特異性分泌IL-17的腸Th17細胞中GDNF受體的表達，并對如何避免同種屬來源一抗的交叉染色等問題進行了分析討論。

1 材料與方法

1．1 主要試劑

Balb／c小鼠購自四川大學實驗動物中心，葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）購自Pharmacia Corporation公司。兔抗鼠抗IL-17抗體和兔抗鼠抗GFR-α1抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，四甲基異硫氰酸羅丹明（Tetramethylrhodam-ine，TRITC）標記山羊抗兔二抗和異硫氰脂熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記山羊抗兔二抗購自北京中山金橋生物技術有限公司。

1．2 構建動物模型

參考Cooper等［4］的文獻報道構建小鼠DSS結腸炎模型。將4-6周齡、體重約20g的Balb／c雌性小鼠以5%（w／v）的DSS溶液讓小鼠自由飲用，每天光照／黑暗各12小時，1周后處死小鼠取結腸組織迅速冰凍切片。

1．3 順序法免疫熒光雙染

組織冰凍切片95%酒精室溫固定10分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘，1%Triton X-100室溫處理10分鐘，PBS洗3次，10%山羊血清37℃封閉1小時，去除山羊血清（不用PBS清洗），抗GFR-α1抗體（1∶500稀釋）4℃孵育過夜，室溫復溫30分鐘，PBS洗3次（以下步驟避光），F(xiàn)ITC標記山羊抗兔二抗37℃孵育1．5小時，PBS洗3次。10%山羊血清37℃再次封閉1小時。抗IL-17抗體（1∶200稀釋）37℃孵育1小時，PBS洗3次，TRITC標記山羊抗兔二抗37℃孵育1小時，PBS洗3次。抗粹滅封片液封片后于熒光顯微鏡下觀察拍照。分別設置一抗A陰性（孵育一抗A時以PBS代替）和一抗B陰性（孵育一抗B時以PBS代替）的單陰對照組。

2 結果

如圖1所示，在小鼠結腸黏膜層、黏膜下層、肌層均可見廣泛的GFR-α1表達，呈FITC標記的綠色，而在黏膜及黏膜下層亦可見IL-17表達，呈TRITC標記的紅色。盡管冰凍切片組織結構欠清晰，但在兩種不同熒光的對比之下，可以看到黏膜及黏膜下層可見被綠色熒光和紅色熒光雙重標記的陽性細胞，提示IL-17＋的Th17細胞表面有GDNF特異性受體亞基GFR-α1表達。一抗A陰性的對照組，除了殘留的少量雜質以外，目標組織幾乎不顯示綠色熒光，一抗B抗陰性的對照組，仍可見紅色熒光顯色，但其強度較弱，可基本被綠色熒光覆蓋。

3 討論

熒光免疫雙染分為直接法和間接法。直接法是指采用不同顏色熒光素直接標記的兩種抗體同時孵育目標組織并顯色的方法，這種方法優(yōu)點是特異性高，可以有效的避免兩種抗體的交叉反應，缺點是敏感性相對較低、且直接標記熒光素的一抗價格昂貴。間接法又分為同步法和順序法，同步法是指兩種不同種屬來源的一抗混合同時孵育目標組織，然后再采用不同顏色熒光素標記的二抗混合同時孵育目標組織，這種方法的優(yōu)點是特異性和敏感性兼顧，實驗操作簡單，性價比較高，因而是目前免疫熒光雙標染色最常使用的方法［5］。但當兩種抗原存在同一部位時，同步法的其中一種一抗可能會妨礙另一種一抗與抗原的結合，導致另一種抗原檢測的敏感性降低，此時，采用順序法，先染色含量較少的抗原，再染色含量較多的抗原，盡管實驗操作流程更為復雜，但可明顯提高含量較少的抗原顯色的敏感性［6］。傳統(tǒng)觀念認為，抗原的識別主要依賴一抗，二抗結合一抗的Fc段，是非特異性的識別，因此，即使是順序法，也應該采用兩種不同種屬來源的一抗，以此避免兩種二抗的交叉反應。但實際工作中常常受實驗條件所限，當有且僅有同一種屬來源的兩種一抗時，是不是就一定無法作出可信的免疫熒光雙染結果呢？

圖1 腸Th17細胞中GDNF受體的表達

首先，我們要清楚順序法間接熒光免疫雙染采用同種屬來源一抗產生交叉反應的原因。第一，當二抗A不足夠結合一抗A時，余留的一抗的Fc段便可能與后來加入的二B結合產生交叉反應，針對第一種情況，如果我們使用的二抗A足量甚至略超過一抗A的結合力、孵育時間又足夠長時，理論上是可以讓一抗A的Fc段完全被二抗A結合的［7］，但這樣就可能帶來第二種交叉反應產生的可能，即過量的二抗A清洗不干凈時，后加入的一抗B可能會與二抗A反應，產生假陽性結果，針對第二種情況，徹底的清洗理論上也可以避免。還有人提出第三種交叉反應的可能，因為每個抗體的結合位點不止一個，如果二抗A超量，那么很可能其與一抗A結合后仍有空著的位點仍有可能與一抗B結合，再加入二抗B時，又與二抗B結合，這樣就出現(xiàn)了重標，針對第三種情況，又有人提出，既然二抗是非特異性的，那么一抗B之前再次使用二抗同源血清封閉，有可能封閉二抗B未結合的位點，避免交叉反應。因此，當一抗為同種屬來源時，適當增加二抗A的濃度并予足夠的孵育時間、徹底清洗，延長血清封閉時間并適當減少一抗B的濃度，理論上是有可能避免抗體之間交叉反應的。本研究將二抗A的濃度提高為說明書推薦濃度的2倍，延長孵育時間至1．5小時，在一抗A和一抗B使用之前均進行二抗同源血清封閉，封閉時間延長至1小時，為減少二抗A的熒光粹滅，一抗B于37℃孵育1小時。結果可見結腸黏膜及黏膜下層被綠色熒光和紅色熒光雙重標記的陽性細胞，并沒有出現(xiàn)因為交叉反應導致兩種熒光表達位置重疊而無法達到實驗目的的情況。

為了進一步探討順序法染色所致的交叉反應對結果判斷的影響，我們分別設置了一抗A陰性和一抗B陰性的對照組。結果顯示，一抗A陰性的對照組，除了殘留的少量雜質以外，目標組織幾乎不顯示綠色熒光，證實我們的清洗方法可徹底清洗非特異性吸附的熒光二抗，有效避免了殘留熒光二抗A與一抗B交叉反應的可能。而一抗B抗陰性的對照組，仍可見強度較弱的紅色熒光顯色，在實驗操作中，我們已經加入了足夠結合一抗A的二抗A并予以了足夠長的孵育時間，故殘留未結合的一抗A Fc段與二抗B結合的可能性較小，而由于一抗B之前再次使用二抗同源血清封閉二抗B未結合的位點的方法缺乏可靠的文獻依據，因此，我們推測一抗B抗陰性的對照組仍可見部分紅色熒光顯色的原因可能為血清封閉其實并不能很好的封閉掉有多個結合位點的二抗A中未予一抗A結合的點，因此仍可能導致部分交叉反應，而這種交叉反應引起的非特異性染色，應該是與一抗A位置幾乎重疊的，這也是許多研究員采用順序法染色得出兩種熒光表達位置完全相同的原因。盡管如此，對照組的紅色熒光強度明顯弱于實驗組，真正的紅色熒光陽性著色部分熒光強度與綠色熒光強度相同甚至更高，使雙標陽性的細胞顯示出明亮的橙色或黃色，已有研究發(fā)現(xiàn)，尤其當兩種目標抗原表達位置不同時，兩種熒光重疊后并不會因為交叉反應所致的非特異性染色而無法判斷陽性結果［8］。正如我們的實驗結果所示，綠色熒光的范圍明線比紅色熒光的范圍廣，提示除IL-17＋細胞外，DSS小鼠結腸炎模型的結腸組織中還有許多其他細胞也表達GFR-α1，這一結果亦與既往文獻報答相符［9，10］。

綜上所述，采用順序法進行免疫熒光雙標記染色，尤其是當已知兩種目標抗原表達位置不同時，通過調整抗體濃度、加強封閉及徹底清洗等辦法，同一種屬來源的一抗仍可得出可信的實驗結果。

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