羅永慧 趙寧寧 劉漪淪 劉衛(wèi)華 張雪蓮莊輝輝 朱小明 吳 江 郭 鵬

1（成都醫(yī)學(xué)院，成都610500）

2（成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，成都610500）

3（成都市南丁醫(yī)用材料有限公司，成都610200）

4（四川大學(xué) 華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，成都610041）

隨著生物技術(shù)和臨床技能的不斷發(fā)展和進(jìn)步，聚乳酸作為生物材料，因其在體內(nèi)最終降解生產(chǎn)無(wú)刺激無(wú)毒的水和CO2且降解周期適宜，漸漸被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，比如外科手術(shù)常用的縫合線［1］，特定藥物釋放系統(tǒng)［2］，組織工程支架材料［3］等。Wang等［5］發(fā)現(xiàn)牙周成纖維細(xì)胞可以在聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸材料上很好的黏附增殖，Duan等［6］將L-929細(xì)胞種植在聚L，L-乳酸賴氨酸材料上，細(xì)胞黏附增殖狀況良好。大量實(shí)驗(yàn)還表明聚乳酸材料不易引起凝血［7-8］，聚乳酸材料與組織具有良好的相容性［9-11］。

角膜盲是主要的致盲性眼病，每年全世界新增約上百萬(wàn)的角膜盲患者。在我國(guó)，角膜盲患者至少在200萬(wàn)以上，而且每年以10%的比例增加。角膜上皮是一種非角質(zhì)化的上皮細(xì)胞，眼睛對(duì)光的可視性有賴于角膜上皮細(xì)胞的規(guī)則排列，角膜上皮細(xì)胞可由角膜緣干細(xì)胞連續(xù)增殖分化而來(lái)，角膜緣干細(xì)胞或者是角膜上皮細(xì)胞的缺乏可引起角膜疾病從而導(dǎo)致世界范圍內(nèi)數(shù)百萬(wàn)人失明［12］。針對(duì)這類患者，進(jìn)行角膜上皮細(xì)胞的移植是有效的。但角膜供體的缺乏及手術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題給角膜上皮細(xì)胞的移植帶來(lái)了巨大的困難。組織工程技術(shù)的發(fā)展開(kāi)啟了移植手術(shù)的新篇章，根據(jù)組織工程技術(shù)的方法和理論指導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)并擴(kuò)增前期，我們用基因誘導(dǎo)的方式將脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞成功誘導(dǎo)其分化為角膜上皮樣細(xì)胞［13］，然后分別以兩種不同制作方法得來(lái)的聚乳酸支架材料為角膜上皮樣細(xì)胞載體，將細(xì)胞種植于支架材料上，通過(guò)觀察細(xì)胞在聚乳酸支架材料上的生長(zhǎng)狀況，以探討兩種不同制作方法的聚乳酸支架材料與角膜上皮樣細(xì)胞的生物相容性，為進(jìn)一步的相關(guān)研究和可能的臨床應(yīng)用提供支持。

1 材料和方法

1．1 材料和設(shè)備

聚乳酸支架材料由成都市南丁醫(yī)用材料有限公司提 供。DMEM、胎 牛 血 清 （HyClone），MTT（Sigma），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司，美國(guó)），酶標(biāo)光度儀（Bio-Tek El312E，美國(guó)），細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning），倒置顯微鏡 （Nikon），伊紅（碧云天）。

1．2 聚乳酸支架材料的制作

流延膜：稱取20g聚乳酸固體粉末，將其加入到盛有100ml乙酸乙酯的燒杯中，在室溫下磁力攪拌，待聚乳酸全部溶解后，將溶液玻璃板上，在干燥室溫環(huán)境下放置一天，待溶劑揮發(fā)，溶液凝固，然后放入真空箱真空干燥24h。將烘干的薄膜揭下，放入樣品袋中保存好。纖維膜熱壓法聚乳酸支架材料：將一定量的聚乳酸溶于丙醇，制成溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液進(jìn)行靜電紡絲。設(shè)定紡絲電壓15KV，流速20ml／h，固定噴絲扣與接收板間的距離為18cm。將所得的聚乳酸纖維膜在70℃溫度下壓制制成支架材料［14］。

1．3 角膜上皮樣細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)及鑒定

取前期實(shí)驗(yàn)獲得的由脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的角膜上皮樣細(xì)胞，37℃水浴融化，離心1000rpm／min，離心3min，加入含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清、青霉素100U／mL、鏈霉素100mg／L的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3d更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合時(shí)，0．25%胰酶消化傳代。取第3代角膜上皮樣細(xì)胞按3×105個(gè)／孔的密度種植于24孔板中，第2d，待細(xì)胞融合至70%左右，PBS洗3次，每次洗10min，4%多聚甲醛固定15min，PBS 洗 3 次，每 次 5min，0．1%Trition X-100室溫穿孔20min，PBS洗3次，每次5min，吸干PBS，滴加正常的山羊血清，室溫孵育30min，吸水紙吸干血清，滴加適量的稀釋比例為1∶500的CK12，放入濕盒至于4℃18h，PBS洗5次，每次5min，吸水紙吸干，滴加適量紅色熒光二抗，避光放入濕盒，至于37℃1h，PBS洗5次，每次5min，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1．4 MTT法對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)

將3×105個(gè)第3代角膜上皮樣細(xì)胞分別種植于纖維膜熱壓法和流延法制作的聚乳酸支架材料上，于24孔板中常規(guī)培養(yǎng)；于第4天將各個(gè)孔的完全培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基后培養(yǎng)12h，每孔加入5g／L的 MTT 80μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清，每孔加入720μl DMSO，振蕩15min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上波長(zhǎng)490nm檢測(cè)各孔吸光度值。

1．5 顯微鏡觀察細(xì)胞在支架材料上的生長(zhǎng)狀態(tài)

分別將纖維膜熱壓法和流延法制作的聚乳酸支架材料剪切成24孔板孔底大小，超凈工作臺(tái)上紫外燈照射消毒，膜兩面分別照射紫外個(gè)半小時(shí)，DMEM完全培養(yǎng)基浸濕備用。用完全培養(yǎng)基重懸第3代角膜上皮樣細(xì)胞，將3×105個(gè)細(xì)胞分別種植于24孔板中的纖維膜熱壓法和流延法制作的聚乳酸支架材料上，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)2d后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞的粘附情況及細(xì)胞的伸展?fàn)顟B(tài)。

1．6 伊紅染色檢測(cè)聚乳酸支架材料上細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況

將3×105個(gè)第3代角膜上皮樣細(xì)胞分別種植于纖維膜熱壓法和流延法制作的聚乳酸支架材料上，于24孔板中常規(guī)培養(yǎng)；于第4天將各個(gè)孔的完全培養(yǎng)基吸出，取出24孔板的聚乳酸支架材料，于PBS洗三遍，95%乙醇固定20min，PBS洗兩遍，侵入伊紅染色液染色10min．自來(lái)水洗滌，洗去非特異性黏附的染料。于顯微鏡下觀察兩種不同制作方法的聚乳酸支架材料上細(xì)胞與伊紅的結(jié)合狀況。

2 結(jié)果

2．1 角膜上皮樣細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)及鑒定

第3代角膜上皮樣細(xì)胞在倒置顯微鏡下可見(jiàn)其形態(tài)似鋪路石狀（見(jiàn)圖1A）；CK12細(xì)胞免疫熒光染色，可見(jiàn)胞質(zhì)呈紅色熒光，即CK12表達(dá)陽(yáng)性，表明該細(xì)胞表達(dá)角膜上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白（見(jiàn)圖1B）。

2．2 角膜上皮樣細(xì)胞在不同聚乳酸支架材料上生長(zhǎng)的觀察

兩種不同的制作方法分別得到兩種不同性質(zhì)和形狀的聚乳酸支架材料，其中，熱壓法聚乳酸支架材料為纖維交織立體結(jié)構(gòu)，而流延法材料為實(shí)性結(jié)構(gòu)，無(wú)孔隙（見(jiàn)圖2B，2F）。角膜上皮樣細(xì)胞種植于纖維膜熱壓法聚乳酸支架材料上4d后，顯微鏡下觀察到膜深層有細(xì)胞長(zhǎng)入并很好的向周圍伸展，而種植于流延法聚乳酸支架材料上的角膜上皮樣細(xì)胞，極少存活（見(jiàn)圖2C，2G）；將上述2組復(fù)合物進(jìn)行伊紅染色，顯微鏡下可見(jiàn)熱壓法材料組有大量細(xì)胞存活，染色為紅色，分布在不同深度的材料內(nèi)部，而流延法幾乎沒(méi)有細(xì)胞存在（見(jiàn)圖2D，2H）。

2．3 MTT法對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)

圖1 角膜上皮樣細(xì)胞形態(tài)與鑒定（×200）Fig．1 Culture and identification of Corneal epithelial-like cell．A：Passage 3of corneal epithelium-like cells，B：Identification of CK12by immunofluorescence（×200）

圖2 角膜上皮樣細(xì)胞在不同聚乳酸支架材料上生長(zhǎng)的觀察Fig．2 Observation of corneal epithelial-like cells growed on the different lactic acid polymer scaffolds

將第三代角膜上皮樣細(xì)胞分別種植于上述2種聚乳酸支架材料上，2、4d后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。熱壓法聚乳酸支架材料組，MTT法檢測(cè)細(xì)胞2、4d吸光度值分別為0．35±0．02，0．77±0．03；流延法組 MTT法細(xì)胞吸光度值分別為0．28±0．04，0．11±0．02；4d后熱壓法組細(xì)胞活力顯著高于流延法組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）（見(jiàn)圖3）。

圖3 角膜上皮樣細(xì)胞活力檢測(cè)Fig．3 Viability of corneal epithelium-like cells

3 討論

術(shù)后粘連是外科手術(shù)常見(jiàn)的和亟待解決的一大難題，形成這一異常的結(jié)構(gòu)，將會(huì)導(dǎo)致患者相應(yīng)部位功能障礙和美觀受損［15］。正常情況下，這一異常的粘連結(jié)構(gòu)將在3d內(nèi)被纖維蛋白酶溶解［16］，但如果溶解不能完成，則會(huì)有成大量成纖維細(xì)胞增生，毛細(xì)血管長(zhǎng)入其中，以形成永久性粘連結(jié)構(gòu)［17］。目前，臨床上使用的防粘連膜的成分多種多樣，聚乳酸就是其中一種［18］。

聚乳酸作為聚酯類生物降解材料的代表，是目前組織工程研究中比較常用的支架材料之一［19］，被廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域，尤其是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，隨著各種改性聚乳酸生物材料的不斷涌現(xiàn)，對(duì)其生物相容性的研究評(píng)價(jià)是日漸倍受關(guān)注，這也為臨床應(yīng)用提供安全可靠的依據(jù)和保障。雖然聚乳酸生物材料的生物相容性已經(jīng)得到大量研究的證實(shí)，但具體不同制作方法的具體聚乳酸生物材料的生物相容性還需在特定應(yīng)用前進(jìn)行前期試驗(yàn)研究。目前的材料分為人工合成材料和天然生物材料兩大類，但還沒(méi)有符合所有標(biāo)準(zhǔn)的材料出現(xiàn)［20，21］．作為臨床應(yīng)用的生物材料，不但要考慮其生物相容性，其降解和吸收速率也是同等重要的，這與其臨床應(yīng)用的安全性直接相關(guān)。有研究報(bào)道：聚合物中各單體的降解和吸收的速率會(huì)有差異，這將有可能引起組織的無(wú)菌性炎癥反應(yīng)［22，23］．聚乳酸生物材料，其降解速度緩慢及其特有的理化性質(zhì)和低免疫原性都已得到證實(shí)［24］。Inouc等［25］已經(jīng)證實(shí)，聚乳酸纖維膜進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)在一定得時(shí)間內(nèi)保持活性，然后逐漸被降解，吸收，最后形成CO2和H2O，最終以呼吸和體液的形式排出體外。

各種不同的制作方法所得的材料之間是存在差異的。由成都市南丁醫(yī)用材料有限公司提供的聚乳酸支架材料一共有四種不同的壓制方法，包括常溫壓制，50℃壓制，纖維膜熱壓法，未壓制和流延法制作，但其中常溫壓制的，50℃壓制的，未壓制的聚乳酸支架材料是不透明的，無(wú)法在顯微鏡下觀察，而電鏡價(jià)格昂貴，所以，我們選擇了透明的纖維膜熱壓法和流延法制作的聚乳酸支架材料來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，以便能更方便更經(jīng)濟(jì)的在顯微鏡下觀察試驗(yàn)效果。纖維膜熱壓法聚乳酸支架材料孔徑大小在幾微米到幾十微米之間，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)的小于角膜上皮樣細(xì)胞的直徑。生物材料的生物相容性是一個(gè)重要的考慮因素，細(xì)胞與支架材料的生物相容性，主要觀察細(xì)胞在材料的生長(zhǎng)增殖活性和生長(zhǎng)狀況，對(duì)于纖維膜熱壓法和流延法制作的兩種不同制作方法的聚乳酸支架材料，我們通過(guò)觀察比較細(xì)胞在這兩種膜材料上的生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖情況，我們發(fā)現(xiàn)纖維膜熱壓法聚乳酸支架材料與角膜上皮樣細(xì)胞的生物相容性明顯優(yōu)于流延法壓制的聚乳酸支架材料，其膜上的角膜上皮樣細(xì)胞活性好，細(xì)胞也是伸展開(kāi)生長(zhǎng)，增殖狀態(tài)良好。但此兩種不同制作方法的聚乳酸支架材料是否是纖維膜熱壓法的比流延法制作的聚乳酸支架材料更適于臨床使用還有待更廣泛的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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