謝芳，楊承劍，唐艷，農(nóng)皓如，楊攀，曾慶坤

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧530001）

0 引言

γ-氨基丁酸（y-Amino Butyric Acid，GABA），是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，具有激活腦內(nèi)葡萄糖代謝、降血氨、降血壓、活化肝、腎功能，改善更年期綜合癥等生理功能[1]。乳酸菌因具有益生功能，可以增強(qiáng)人體免疫力，提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2-3]利用其發(fā)酵條件優(yōu)化等措施而生產(chǎn)富含GABA的乳制品已成為目前研究的熱點(diǎn)[4]。富含GABA的發(fā)酵乳中的γ-氨基丁酸、乳酸菌增殖因子等，能顯著調(diào)節(jié)機(jī)體機(jī)能，起到防病治病的作用[5-6]。水牛乳作為南方地區(qū)特有的乳制品，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值頗高，本試驗(yàn)利用從水牛乳中分離出的高產(chǎn)GABA的乳酸菌為出發(fā)菌株，將其應(yīng)用到水牛乳酸奶的發(fā)酵中，研制富含GABA的功能性酸奶，為今后水牛乳系列產(chǎn)品的深加工提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

新鮮水牛乳：于當(dāng)天取自水牛研究所種牛場(chǎng)，白砂糖（市售）。

酸奶菌種：德氏乳桿菌保加利亞亞種（1.2717 Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus），嗜熱鏈球菌（1.2718 Streptococcus thermophilus），產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌種（自水牛奶中分離所得），經(jīng)鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種，實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基及試劑：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為脫脂后的水牛乳，MRS培養(yǎng)基，MRS肉湯培養(yǎng)基，L-谷氨酸單鈉鹽，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備

SPX-150生化培養(yǎng)箱，YM50立式壓力蒸汽滅菌器，5804R高速冷凍離心機(jī)，LNG-T88臺(tái)式快速冷凍離心機(jī)，尼康ECLIPSE 50i正置生物顯微鏡，SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，THZ-82A恒溫振蕩器，美國(guó)FTC-質(zhì)構(gòu)儀（TMS-Pro），HI8424便攜式pH檢測(cè)儀，乳脂分離機(jī)，美的冰箱等。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

生水牛乳→凈化→均質(zhì)→配料→殺菌→接種（按實(shí)驗(yàn)條件）→發(fā)酵→后熟

1.3.2 檢驗(yàn)方法

（1）乳酸菌的檢測(cè)方法。采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)[7]。

（2）pH值的測(cè)定。用HANNA（意大利哈納）HI8424便攜式酸度測(cè)定。

（3）GABA測(cè)定。產(chǎn)GABA菌種及混合發(fā)酵劑，空白對(duì)照酸奶及樣品酸奶GABA的測(cè)試均直接送檢至廣西分析測(cè)試中心完成。

（4）酸度測(cè)定參考GB 5413.34-2010[8]。

（5）感官評(píng)價(jià)。根據(jù)GB19302-2010標(biāo)準(zhǔn)的感官評(píng)定要求[9]，請(qǐng)實(shí)驗(yàn)室5位同事對(duì)實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]如表1所示：

表1 GABA酸奶的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）發(fā)酵劑的制備 菌種的選擇。本研究采用從生鮮水牛乳中篩選出的一株高產(chǎn)GABA乳酸菌，與傳統(tǒng)酸奶菌種保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為出發(fā)菌株，先將其用MRS肉湯培養(yǎng)基活化，再用脫脂水牛乳傳兩代后擴(kuò)大培養(yǎng)至穩(wěn)定期，收集菌體，再將這三種菌株按體積比1∶1∶1制成混合菌種，用于發(fā)酵制備富含GABA的水牛乳酸奶。

（2）單因素及正交實(shí)驗(yàn)。分別對(duì)菌種選擇、配比、L-Glu等底物的添加量、發(fā)酵溫度等因素對(duì)酸奶品質(zhì)及GABA產(chǎn)量的影響進(jìn)行分析，將確定的四個(gè)單因素設(shè)計(jì)成L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)[11]，以期得到GABA水牛乳酸奶的最佳發(fā)酵條件。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正交結(jié)果方差分析；其它數(shù)據(jù)計(jì)算、繪圖采用Microsoft Excel 2003。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的選擇

本研究對(duì)同等發(fā)酵條件下，采用傳統(tǒng)菌種（保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌）發(fā)酵的普通酸奶和采用產(chǎn)GABA的乳酸乳球菌單菌發(fā)酵的酸奶分別進(jìn)行GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)普通酸奶中無(wú)GABA存在，而單獨(dú)利用乳酸乳球菌發(fā)酵的酸奶，其產(chǎn)GABA的量均在0.005 mg/g左右，將此單菌按不同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別添加于滅菌水牛乳中于37℃發(fā)酵，其凝乳時(shí)間、酸度、GABA質(zhì)量濃度及組織狀態(tài)，如表2所示。

表2 產(chǎn)GABA乳酸菌單菌發(fā)酵情況

由表2可以看出，若采用此單菌發(fā)酵酸奶，按接種量9%，其凝乳時(shí)間要最短也要16.5 h，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，且其酸度值均在70以下，不符合發(fā)酵乳的酸度要求標(biāo)準(zhǔn)[9]。本研究選擇采用混菌方式發(fā)酵，以提高酸奶的發(fā)酵效率和品質(zhì)。

2.2 L-Glu添加量對(duì)含GABA水牛奶酸奶的影響

因谷氨酸鈉（L-Glu）是GABA產(chǎn)生的前體物質(zhì)[12]，而加入谷氨酸鈉會(huì)對(duì)酸奶的風(fēng)味造成一定影響，但為富集更多的GABA，在考慮其對(duì)酸奶影響最小的范圍內(nèi)加入3‰，5‰，7‰，9‰，11‰質(zhì)量分?jǐn)?shù)的谷氨酸鈉，在37℃培養(yǎng)，待酸奶達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)后，測(cè)定其GABA的質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 谷氨酸鈉添加量對(duì)酸奶產(chǎn)GABA量的影響

由圖1可以看出，當(dāng)谷氨酸鈉的添加量在5‰左右時(shí)，其酸奶中GABA質(zhì)量濃度最高，當(dāng)添加量在6‰至10‰時(shí)，GABA質(zhì)量濃度處于平緩，隨著酸奶中L-Glu的不斷消耗，GABA的質(zhì)量濃度也呈上升趨勢(shì)，故從酸奶風(fēng)味、GABA質(zhì)量濃度兩方面綜合考慮，選擇谷氨酸鈉添加量為3‰～6‰最為合適。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)底物添加量、發(fā)酵溫度等作進(jìn)一步優(yōu)化，采用L9（34）平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，待酸奶達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)后放入4℃冰箱，測(cè)定其在24 h后GABA的質(zhì)量濃度。分析各因素對(duì)酸奶GABA產(chǎn)量的顯著性差異，結(jié)果如表3～表5所示。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表4可以看出，4個(gè)因素對(duì)酸奶GABA產(chǎn)量的影響順序?yàn)椋篖-Glu添加量（C）＞混合菌種配比（B）＞乳酸乳球菌的接種量（A）＞發(fā)酵溫度（D）。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，富含GABA酸奶的最優(yōu)工藝組合為A1B2C3D2，即乳酸乳球菌的接種量為3%，混合菌種配比為 1∶0.5∶1，L-Glu 添加量為 6‰，發(fā)酵溫度為37℃。

由表5可以看出，只有C因素L-Glu添加量與酸奶GABA產(chǎn)量差異顯著（P＜0.05），因素A乳酸乳球菌的接種量、B混合菌種配比、D發(fā)酵溫度均與酸奶GABA產(chǎn)量差異不顯著（P＞0.05）。

最后對(duì)組合A1B2C3D2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，成品酸奶中GABA的質(zhì)量濃度為0.7 g/L，且產(chǎn)品組織狀態(tài)良好，口感清爽，酸甜適中，感官評(píng)分為91分。

2.4 貯存過程中乳酸菌活菌數(shù)及pH值的變化

分別檢測(cè)儲(chǔ)存于4～8℃的普通水牛乳酸奶與含GABA水牛乳酸奶的pH值及乳酸菌活菌數(shù)，其變化情況如圖2所示。由圖2可以看出，在保質(zhì)期內(nèi)，GABA酸奶的乳酸菌活菌數(shù)及pH值均明顯高于普通酸奶，這說明產(chǎn)GABA乳酸菌對(duì)酸奶中的乳酸菌總菌數(shù)有一定的促進(jìn)作用。在第8天時(shí)乳酸菌活菌數(shù)保持在108mL-1以上，符合發(fā)酵乳活菌數(shù)的要求標(biāo)準(zhǔn)[9，13]；8天內(nèi)其pH值均在4.0以上，說明其后酸化是可控的[14-15]。

圖2 貯存期間乳酸菌菌落對(duì)數(shù)（lg）和pH值變化

2.5 產(chǎn)品的質(zhì)量指標(biāo)

2.5.1 感官

表面光滑、呈乳白色，具有水牛乳酸奶特有的滋味、氣味，組織細(xì)膩、均勻，有少量乳清析出，無(wú)異味。GABA酸奶與普通酸奶在口感、酸度、組織狀態(tài)等方面均無(wú)明顯差異。

2.5.2 理化、微生物

酸奶的理化、微生物指標(biāo)如表6和表7所示，均符合GB 19302-2010《發(fā)酵乳》質(zhì)量要求。

表6 GABA酸奶的理化指標(biāo)

表7 GABA酸奶的微生物指標(biāo)

3 結(jié)論

（1）從生水牛乳中分離出的產(chǎn)GABA的乳酸乳球菌，按適當(dāng)?shù)谋壤c傳統(tǒng)酸奶菌種混合，可應(yīng)用于水牛乳酸奶的發(fā)酵，其產(chǎn)品中GABA質(zhì)量濃度高，且感官良好，各項(xiàng)理化、微生物指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

（2）當(dāng)產(chǎn)GABA乳酸乳球菌的接種量為3%，乳球菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌配比為1∶0.5∶1，L-Glu添加量為6‰，發(fā)酵溫度為37℃時(shí)，所得產(chǎn)品的感官及組織狀態(tài)最佳，且GABA質(zhì)量濃度最高可達(dá)0.7 g/L。

[1]韓梅,徐致遠(yuǎn),于鵬.富含丫一氨基丁酸酸奶的研制[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012，34（3）：595-596.

[2]徐明生，黃占旺，上官新晨，等.凝固型雙歧桿菌酸奶研制[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21（1）：120.123.

[3]王英，周劍忠，陳曉紅，等.新疆酸馬奶中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及發(fā)酵特性分析[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（5）：807—8l1.

[4]薛玉清，單藝，滿朝新，等.γ-氨基丁酸發(fā)酵乳的研制[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（11）：84-85.

[5]閆天文，滿朝新，任歡，等.富含γ-氨基丁酸酸奶的制備及質(zhì)構(gòu)特性研究[J].中國(guó)食品與營(yíng)養(yǎng)，2014，20（7）：49-50.

[6]YAZICI F,ALVAREZ V B.Fermentation and Proper ties of Calcium-fortified Soy milk Yogurt[J].Joumal of Food Science,1997,62：457-461.

[7]劉韓，關(guān)宏，楊文欽，等.青春雙歧桿菌凝固型酸奶研制及選擇性培養(yǎng)基比較.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42（5）：36—40.

[8]GB 5413.34-2010《乳和乳制品酸度的測(cè)定（第二法乳及其他乳制品酸度的測(cè)定）》[S].

[9]GB 19302-2010.《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（發(fā)酵乳）》[S].

[10]李靖，陳偉，李小永，等.靈芝酸奶的研制[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2011,39（5）：60-61.

[11]梅芳，喬成亞，李海燕，等.褐色甜酒釀乳酸菌飲料的加工工藝研究[J].中國(guó)釀造，2014，33（11）：160-161.

[12]劉寧寧.產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及作為酸奶發(fā)酵條件的研究[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2010：22-23.

[13]GB2746—1999.《酸牛乳乳酸菌數(shù)的規(guī)定》[S].

[14]UPAYITITPATANA P，WIRJANTORO T I，RAVIYAN P.Characteristics and shelf-life of corn milk yogurt[J].CMU J.Nat.Sci.，2010，9（1）：133-148.

[15]JAICHNNIJAI P，VALYASEVI R，ASSAVANIG A，et al.Isolation and characterization of acid-sensitive Lactobcillus plantarum with application as starter culture for Nham production[J].Food Microbiol，2010（6）：741-748.