程國棟，吳小慧，張宇，李曉丹，吳方舟，王丹，金珠

（1.蒙牛乳業(yè)（馬鞍山）有限公司，安徽馬鞍山243000；2.內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，呼和浩特010000）

0 引言

三聚氰胺（melamine）分子式為C3N6H6，分子量為126.12 u，屬于三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物[1]，廣泛用于木材、塑料、涂料，造紙等行業(yè)[2]，具有一定的腎毒性。因其含氮量高達66.6%，一些不法分子利用“凱氏定氮法”是通過測定牛奶中含氮量來折算蛋白質質量分數的方法漏洞，將三聚氰胺人為添加到生乳中，達到提高蛋白質質量分數目的，獲得不法利益。

目前檢測三聚氰胺有ELISA法[3-4]、液相色譜法[5-6]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法[7]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[8-9]等。ELISA法對乳品的檢測具有局限性，且特異性較差；儀器法雖能精確定量，但前處理繁瑣，設備昂貴，對操作人員專業(yè)要求高。

近年來也有利用膠體金免疫層析法檢測乳品中三聚氰胺，但集中于生乳和奶粉[10-12]，針對乳制品研究較少。因此建立膠體免疫層析法檢測乳制品中三聚氰胺是有必要的，也具有實際意義。

1 實驗

1.1 主要儀器

溫育器，試紙條讀數儀，移液器，計時器，超純水器，漩渦混合儀，電子天平，高效液相色譜儀。

1.2 試劑與耗材

易瑞成品乳三聚氰胺快速試紙條，三聚氰胺標準品，雙氧水，青霉素G，糊精，銨鹽，碳酸氫鈉，尿素，實驗用水為超純水。

1.3 方法

1.3.1 檢測原理

三聚氰胺定性檢測試紙條應用了競爭抑制膠體金免疫層析的原理（結構如圖1所示）。樣本中的三聚氰胺在流動的過程中與膠體金標記的特異性單克隆抗體結合，抑制了抗體和硝酸纖維素膜（NC膜）檢測線（T線）上的三聚氰胺-BSA（牛血清蛋白）偶聯(lián)物的結合，從而導致檢測線與控制線顏色深淺的變化，進行結果的判定。

圖1 三聚氰胺快速試紙條結構

1.3.2 試紙條的驗收

取經確認不含三聚氰胺的12%復原乳做本底空白樣品，并用其制備質量濃度為150 μg/L的三聚氰胺加標樣品，用試紙條對以上兩個樣品做平行檢測。當復原乳本底樣品檢測結果為陰性，三聚氰胺加標樣品檢測結果為陽性，試紙條方可使用。

1.3.3 檢測步驟

樣品與水1∶1進行振蕩混合均勻（如：5 g樣品，加入5 mL水，混勻），待測。將試紙條從冰箱中拿出，恢復至室溫。從試紙桶中取出白色微孔，移取300 μL待測樣品于白色微孔中，用移液器抽吸5～10次，混合均勻；將上述制備好的白色微孔樣液全部轉移至對應的紅色微孔中混勻，置于溫育器中40℃±1℃溫育6 min；溫育結束后，將試紙條插入到微孔中（吸水海綿端朝下）40℃±1℃溫育7 min；然后從微孔中取出試紙條，輕輕刮去試紙條下端的吸水海綿，進行結果判讀；實驗完畢后，將試紙條放入盒中密封，于2～8℃保存。

2 結果與分析

2.1 結果判定

試紙條檢測結果的判定可分為肉眼判定和讀數儀讀數判定兩種方式，具體判定方式可根據實際情況進行選擇。

2.1.1 肉眼判定

膠體金免疫層析法結果的判定如圖2所示：當檢測線（T線）和控制線（C線）均出現(xiàn)紅色條帶時，若T線的紅色條帶顏色較C線深，為陰性（-），反之則為陽性（+）；當試紙條T線有紅色帶，C線無紅色帶時，為陰性（-），反之當試紙條T線無紅色條帶，C線出現(xiàn)紅色條帶，則為陽性（+）；若T線和C線兩條線全無色帶，則試紙條檢測結果無效。

圖2 三聚氰胺快速試紙條檢測結果的判定

2.1.2 讀數儀讀數判定

當試紙條上T線和C線顏色相同時，所對應樣品中三聚氰胺的質量分數為樣品的檢出限，此時讀數儀讀數為1.1，當使用讀數儀讀數時結果大于1.1時為陰性（-），小于或等于1.1時為陽性（+）。個別樣品的判讀數值有所不同，例如：兒童奶樣品，當T線與C線顏色相同時數值為1.8。

2.2 檢出限實驗

由于目前市場上乳制品種類繁多，實驗選取滅菌乳、調制乳、巴氏殺菌乳、原味酸牛奶和果粒酸牛奶5類樣品進行檢出限實驗驗證。分別取2個批次的三聚氰胺膠體金試紙條分別對添加質量分數為50，100，200 μg/kg上述加標樣品進行重復6次檢測，結果如表1所示。

表1 膠體金免疫層析試紙條檢出限實驗

由表1可以看出，巴氏殺菌乳檢出限為50 μg/kg，滅菌乳、調制乳，原味酸牛奶的檢出限為100 μg/kg，果粒酸牛奶的檢出限為200 μg/kg。由于每個乳品加工企業(yè)生產滅菌乳、調制乳、巴氏殺菌乳、原味酸牛奶和果粒酸牛奶的工藝各不相同，這就造成了樣品基質種類繁多，為了保證實驗的科學、嚴謹和準確性，在日常檢測工作中應該對每類產品的每種產品的檢出限進行評定，以確定相應樣品的檢出限。從表1也可以看出，不同批次檢的膠體金免疫層析試紙條檢測結果存在一定的差異，所以在進行檢出限評定時，至少要選用2個批次的試紙條進行實驗，以確保實驗結果的準確。

2.3 重復性實驗

實驗分別選取滅菌乳、調制乳、巴氏殺菌乳、原味酸牛奶和果粒酸牛奶樣品中的一種代表性產品進行重復性檢測。實驗選取2個批次的膠體金免疫層析試紙條，分別檢測本底樣品，1倍檢出限和2倍檢出限加標樣品，每個樣本使用不同批次的試紙條同時檢測6次，結果如表2所示。

表2 膠體金免疫層析試紙條對牛奶樣品的重復性實驗結果

由表2可以看出，2個批次的三聚氰胺檢測本底樣品時，結果均為陰性；檢測添加三聚氰胺1倍檢出限和2倍檢出限樣本時，結果均為陽性，檢測結果一致，重復性良好。

2.4 穩(wěn)定性實驗

實驗各選取上述5類樣品中一種代表性產品，分別添加三聚氰胺標準品，制成陽性樣品。然后用2個批次三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條分別平行檢測2次，檢測結果均呈陽性。對上述樣品用相同的方法連續(xù)檢測7 d，檢測結果也全部為陽性，說明三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條日內、日間的穩(wěn)定均良好。試紙條保存于2～8℃的環(huán)境中，12個月保質期內仍可以特異性檢出陽性，并且靈敏度沒有降低。

2.5 特異性實驗

2.5.1 陰性干擾

實驗將確定不含有三聚氰胺牛奶樣品制成含有脂肪層、酸敗樣品、質量濃度20 mg/L的雙氧水、0.1%碳酸氫鈉、100 μg/kg青霉素G、0.2%糊精、0.1%銨鹽、1%尿素（均為質量分數）的干擾樣品，分別做陰性和陽性干擾，檢測結果如表3所示。

表3 三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條陰性抗干擾實驗結果

2.5.1 陽性干擾

將上述制備的陰性干擾樣品制備成含有質量分數為200 μg/kg的三聚氰胺加標樣品，用膠體金免疫層析試紙條進行檢測，具體結果如表4所示。

通過表3特異性實驗數據可知，尿素對純牛奶、滅菌乳和巴氏殺菌乳樣本產生了干擾，出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，但其對酸牛奶未產生干擾。為了進一步驗證尿素的干擾情況，實驗增加了朱古力牛奶、香草牛奶等液體奶和黃桃果粒酸牛奶、草莓果粒酸牛奶、凝固型原味酸牛奶等發(fā)酵乳的尿素陰、陽性抗干擾實驗。實驗結果顯示朱古力牛奶、香草牛奶等液體奶的陰性干擾仍然呈“+”，酸牛奶的陰性干擾呈“-”，所有產品的陽性干擾均呈現(xiàn)“+”。由此可以得出尿素對膠體金免疫層析試紙條檢測液態(tài)奶中三聚氰胺存在干擾現(xiàn)象。

2.6 與儀器法對比實驗

因膠體金免疫層析試紙條的檢出限于儀器法的檢出限存在一定的差別，目前我國乳品加工企業(yè)大多采用GB/T 22388-2008中液相法來檢測乳及乳制品中三聚氰胺，該方法的檢出為2 mg/kg。我國食品安全法禁止人為在乳品中添加三聚氰胺，但牛奶可能會因包材中三聚氰胺的遷移導致檢出三聚氰胺，所以我國將牛奶中三聚氰胺的限量標準定為2.5 mg/kg，故實驗選擇陰性樣品和添加含有質量分數為2 mg/kg的三聚氰胺牛奶樣品來進行試紙條法與液相法的對比實驗，這樣能夠有效地保證在標準之下兩種方法均能有效檢出。結果如表5所示。

由表5可以看出，試紙條法檢測結果與液相法檢測結果相一致，表明試紙條可用于滅菌乳、調制乳、巴氏殺菌乳和發(fā)酵乳中三聚氰胺的快速篩選檢測。

2.7 批量檢驗結果

連續(xù)一個星期使用三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條對上述5類不同品種樣品進行檢測，每天檢測量為約25個樣品，實驗過程均正常，樣品檢測結果均為陰性，同時液相法的檢測結果均為未檢出。

2.8 注意事項

為了杜絕檢測過程中一些不適宜因素導致檢測結果出現(xiàn)異常，需注意以下幾點：①請勿混用來自不同批號的試紙條和試劑微孔，請勿使用超過保質期的試紙條；②試紙條和微孔均為一次性使用，不要觸摸試紙條中央的白色膜面；③對于發(fā)酵乳，為了讓液體充分浸透海綿，插入試紙條后應反復多次的將白色海綿端緊貼微孔片刻；④遇到樣品層析速度過慢，第二次溫育時液體未能上升至C線處時，可延長2～3 min溫育時間；⑤第二步溫育結束后需在5 min內觀察或讀取結果，超過時間結果判讀無效；⑥多個樣品同時進行檢測時，盡可能的保持操作步驟統(tǒng)一；⑦試紙條檢測結果出現(xiàn)陽性時，應該選用相關儀器法進行確證。

表4 三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條陽性性抗干擾實驗結果

表5 試紙條法與液相法檢測結果對比

3 結論

通過一系列性能評價實驗，三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條法檢測時間在20 min內，檢出限為50～200 μg/kg，批間重復性和批內重復性良好，檢測結果與液相法檢測結果一致。方法簡便，對人員專業(yè)技能要求相對低，靈敏度、穩(wěn)定性和特異性等均達到了食品中有毒有害物質快速檢測的要求，非常適用于乳品加工企業(yè)對樣品的粗篩選檢測工作，為產品盡早的投放市場提供前提保障。

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