李琳瑤，田成新，滿朝新，婁彬彬，牛婕婷，張立東，姜毓君

（東北農業(yè)大學 a.食品學院乳品科學教育部重點實驗室；b.國家乳業(yè)工程技術研究中心，哈爾濱150030）

0 引言

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，牛奶的人均消費量也大幅度增加，農藥殘留作為影響牛奶安全的因素之一，受到高度重視。乙草胺是美國孟山都公司于1971年開發(fā)的一種芽前選擇性酰胺類除草劑，用于防除玉米中一年生禾本科雜草和某些一年生闊葉雜草，是世界上最常用的除草劑之一[1]。目前產量仍有逐年增加的趨勢，特別是在中國[2]。但乙草胺有潛在的致癌風險，歐盟規(guī)定牛乳（cattle milk）中乙草胺的最大殘留限量（MRL）為0.01 mg/kg[3]，我國并未規(guī)定牛乳中乙草胺的限量標準。因此，為了消費者的健康安全，檢測牛乳中乙草胺的殘留量十分重要。

本研究建立了一種牛乳中乙草胺的氣相色譜-質譜聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS）[4-6]檢測方法，可以監(jiān)測牛乳中乙草胺水平，保障乳制品安全。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

乙草胺標準品（純度為92.5%），乙腈、丙酮、乙酸乙酯（色譜純），氯化鈉（分析純），PSA、Cleanert Pesti-Carb，無水硫酸鎂（純度為99.5%）。

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，GENIUS 3漩渦震蕩器，AL204型電子分析天平，L-550低速自動離心機，冷凍離心機，N-EVAP氮吹儀。

本研究所用牛乳采自哈爾濱市郊奶牛養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

本研究采用2003年由美國農業(yè)部Anastassiades教授開發(fā)的一種新型樣品前處理方法-QuEChERS法（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged and Safe）并加以改進，原理是利用吸附劑與樣品基質中的雜質相互作用，吸附雜質從而達到凈化的作用，分為提取和凈化兩個步驟。

（1）提取。準確稱取2.0 g牛乳樣品（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入0.5 g氯化鈉、10.0 mL乙腈，漩渦振蕩5 min，以轉速為4 000 r/min離心5 min，再準確移取5.0 mL上清液于玻璃試管中，40℃氮吹至干，待凈化。

（2）凈化。將所得樣品用1.0 mL丙酮定容，漩渦均勻后轉移到裝有基質分散劑（0.15 g無水硫酸鎂、0.15 g PSA、0.02 g Cleanert PestiCarb石墨化炭黑）的2 mL離心管中，漩渦均勻，以轉速為15 000 r/min離心10 min，靜止片刻，取適量上清液供氣相色譜-質譜聯(lián)用儀測定。

1.2.2 氣相色譜-質譜條件

氣相色譜條件：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 μm ×250 μm）；色譜柱溫度：80 ℃保持2 min，然后以15℃/min升溫至200℃，再以30℃/min升溫至270℃保持10 min；不分流進樣方式；進樣量1 μL；進樣口溫度250℃；載氣為氦氣（純度≥99.999%），流速1 mL/min。

質譜條件：色譜-質譜接口溫度280℃；電離方式為EI；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；選擇離子監(jiān)測模式；選擇監(jiān)測離子（豐度比）：定量離子223（63），定性離子146（100）、162（75）、269（9）；溶劑延遲3 min。

1.3 定性與定量原則

定性分析：在利用GC-MS檢測牛乳中乙草胺時，利用乙草胺色譜峰的保留時間進行定性判斷，樣品中乙草胺的出峰時間與標準溶液相一致，兩者允許誤差在±0.5%之內；同時要看樣品質譜圖中扣除背景噪音后四個碎片離子是否均出現(xiàn)，四個特征碎片離子m/z 146、m/z 162、m/z 223和m/z 269（相對豐度比100∶75∶63∶9）與標準溶液相應離子的相對豐度比一致，相似度在允許相對誤差之內，則可判斷樣品中存在乙草胺。此外可進行NIST譜庫檢索，選擇匹配度較高的結果，進行結構式查詢來進一步判斷。

定量分析：采用外標法定量分析，用標準儲備液配成不同濃度的標準溶液，在與待測樣品完全相同的操作條件下，測得標準溶液的響應值，以響應值對濃度做標準曲線，將待測化合物測得的響應值代入標準曲線即可求得其濃度。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的選擇

牛乳中含有大量的物質，基質成分相對復雜，在檢測牛乳中乙草胺的含量時，需要排除牛乳中蛋白質、脂肪和其他干擾物的影響，故需要選擇一種提取效果較好的提取試劑，將乙草胺從牛乳中大量充分的提取出來。根據(jù)待測物與提取試劑的“相似相溶”原理，本試驗選擇乙腈、丙酮、乙酸乙酯作為提取試劑，比較發(fā)現(xiàn)：乙腈的提取效果最好，同時可以沉淀牛乳中的蛋白質；丙酮的脂溶性較大、提取的油脂多、干擾雜質也多、不利于后續(xù)試驗的進行；乙酸乙酯容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，為后續(xù)凈化帶來不便[7]。因此綜合考慮，最終選擇乙腈作為本試驗的提取試劑，乙腈不僅可以充分提取出牛乳中的乙草胺，而且可以作為沉淀劑沉淀牛乳中的蛋白質，隨后通過加入氯化鈉可以實現(xiàn)乙腈與水層的快速分離[8]。

2.1.2 提取方式的選擇

本試驗考察了3種不同提取方式提取牛乳中乙草胺的提取效果，分別為振蕩提?。? min，提取1次），超聲提?。?0 min，提取1次）和均質提?。?4 000 r/min，1 min，提取1次），其他實驗條件相同。將提取處理后的乙草胺樣品濃縮凈化并上機測定，每個樣品平行測定3次，比較不同提取方式的加標回收率大小，選擇回收率最高的提取方式作為本試驗的最佳提取方式。以提取方式的種類為橫坐標，回收率（%）為縱坐標，繪制柱狀圖，如圖1所示。

圖1 乙草胺不同提取方式對比結果

由圖1可知，振蕩提取、超聲提取和均質提取三種不同提取方式的回收率分別為98.82%、93.71%、94.18%，振蕩提取方式的回收率略高于超聲提取和均質提取，同時振蕩提取方式操作簡單，均質提取容易對樣品造成一定的污染，最終選擇振蕩提取方式作為本試驗的最佳提取方式。

2.1.3 基質分散劑的選擇

在用乙腈提取牛乳中的乙草胺時，雖然乙腈的提取效果很好而且可以沉淀牛乳中的部分蛋白質，但不可避免同時提取出牛乳中的其他基質成分，從而干擾乙草胺后續(xù)的定性和定量分析，因此，需要在提取的基礎上進行必要的凈化處理。本試驗選擇無水硫酸鎂、PSA（N-丙基乙二胺）和Cleanert PestiCarb（石墨化碳黑）同時作為凈化劑和吸附劑處理牛乳中的乙草胺，無水硫酸鎂可以除去牛乳基質中的水分，PSA有較弱的陰離子交換能力，可以吸附牛乳基質中的脂肪酸、有機酸、碳水化合物、糖類、酚類和色素等雜質，Cleanert PestiCarb（石墨化碳黑）可以吸附牛乳基質中的色素、類胡蘿卜素、固醇和平面結構極性大的基質干擾物[9-12]。

同時吸附劑用量是影響樣品凈化效果的重要因素，本試驗根據(jù)待測目標化合物性質和樣品情況選擇合適的吸附劑用量，若用量過少，待測物乙草胺凈化效果差且回收率低；若用量過多，待測物乙草胺凈化效果雖好但成本增加且回收率也低，尤其是石墨化碳黑用量過多，會嚴重吸附目標化合物[11]。綜合考慮選擇無水硫酸鎂0.15 g，PSA 0.15 g和Cleanert PestiCarb（石墨化碳黑）0.02 g作為本試驗的基質分散劑的用量，取得了很好的凈化效果且回收率高，能夠達到牛乳中乙草胺殘留分析的要求。

2.2 GC-MS條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的確定

將質量濃度為300 μg/L的乙草胺標準溶液經GC-MS上機測定，選擇離子監(jiān)測模式，所得乙草胺標準溶液的總離子色譜圖（TIC）如圖2所示，定量離子（223）色譜圖如圖3所示，色譜峰光滑、對稱、呈正態(tài)分布、無雜峰干擾、基線為一條水平直線。

圖2 乙草胺標準溶液總離子色譜

圖3 乙草胺標準溶液定量離子（223）色譜

2.2.2 質譜條件的確定

將質量濃度為300 μg/L的乙草胺標準溶液經GC-MS上機測定，在全掃描模式（SCAN）下對m/z 50～500范圍內的碎片離子進行分析，得到乙草胺全掃描質譜圖，如圖4所示。

圖4 乙草胺全掃描質譜圖

由圖4所示，乙草胺經電離產生一系列碎片離子，選擇豐度高、專屬性強、受外源組分干擾少、空白樣品無特征的碎片離子作為選擇離子監(jiān)測模式（SIM）分析時的特征碎片離子。綜合考慮，本試驗選擇m/z 146、m/z 162、m/z 223、m/z 269作為乙草胺的選擇離子監(jiān)測的特征碎片離子，其中m/z 146、m/z 162、m/z 269為定性離子，m/z 223為定量離子，得到乙草胺選擇離子監(jiān)測質譜圖，如圖5所示。

圖5 乙草胺選擇離子監(jiān)測質譜圖

2.3 線性范圍與定量限

在確定的色譜及質譜條件下，將 5，10，20，50，100，200，300 μg/L共7個質量濃度梯度的乙草胺標準溶液上機測定，每個濃度平行測定三次，以乙草胺標準溶液的質量濃度為橫坐標，響應值為縱坐標，繪制標準曲線。得到乙草胺的線性回歸方程為y=320.5x-728.91，相關系數(shù)（R2）為0.9991，乙草胺在5～300 μg/L質量濃度范圍內線性關系良好，呈正相關，能夠達到日常工作需要。

向空白樣品中添加乙草胺標準溶液，平行測定5次，以S/N=10對應的質量分數(shù)為該方法的定量限，求得定量限為0.5 μg/kg，可以滿足農殘檢測要求。

2.4 回收率與精密度

在確定的色譜及質譜條件下，向空白樣品中添加三個不同質量濃度梯度的乙草胺標準溶液，添加質量濃度分別為20，50，100 μg/L，進行加標回收試驗，每個質量濃度5次平行，結果如表1所示。可知，乙草胺的加標平均回收率范圍為93.42%～98.82%，相對標準偏差范圍為2.00%～2.61%，回收率滿足農殘試驗要求，相對標準偏差范圍合理。

表1 乙草胺的加標回收率與精密度

2.5 穩(wěn)定性實驗

穩(wěn)定性分析一般是指樣品標準溶液或待測物在不同溫度條件下（如室溫，冷卻和反復冷凍解凍），其標準物或待測物的穩(wěn)定情況。將儲存于4℃條件下的乙草胺儲備液，選擇第0天、第10天、第20天、第30天上機測定，測定前用丙酮稀釋至100 μg/L的乙草胺標準溶液，觀察30天內乙草胺的濃度變化情況。結果如圖6所示?？芍?，乙草胺標準溶液在30天內的響應值略有下降，但并不明顯，說明乙草胺在4℃條件下，30天內穩(wěn)定性良好。

圖6 4℃條件下乙草胺的穩(wěn)定性

3 結論

本研究建立了一種利用氣相色譜-質譜聯(lián)用法檢測牛乳中乙草胺的方法。采用改進的QuEChERS樣品前處理方法，通過乙腈提取乙草胺并沉淀牛乳中的蛋白質，氮吹濃縮，基質分散劑（無水硫酸鎂、PSA和Cleanert PestiCarb石墨化炭黑）凈化處理，采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行檢測。結果表明，該方法簡單、靈敏、準確度高、成本低、實用性強，適用于大批實際牛乳樣品的檢測分析。

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