王霄鵬，呂嘉櫪，閆亞梅，李文娟，杜冰

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,西安710021）

0 引言

發(fā)酵食品是一類利用微生物發(fā)酵制得的產(chǎn)品，在中國(guó)有著悠久的歷史和豐富的文化內(nèi)涵[1]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明：傳統(tǒng)發(fā)酵食品不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的口感風(fēng)味，還含有很多活性成分，使發(fā)酵食品具有一定的保健功能，如降血脂、調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境、降血糖及提高免疫力等[2-4]。益生菌本身具有很多對(duì)人體有益的功效[5]。

本研究從西北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵果蔬和乳品中分離篩選出5種乳桿菌，分別為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）主要針對(duì)降脂性能以及降脂機(jī)制研究其益生功能，加強(qiáng)乳桿菌及發(fā)酵食品的功能性，為乳桿菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與試劑

從西北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵果蔬和乳品中分離篩選出的嗜酸乳桿菌（LA），保加利亞乳桿菌（LB），干酪乳桿菌（LC），植物乳桿菌（LP），鼠李糖乳桿菌（LGG），由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院提供。膽固醇，蔗糖酯，膽固醇試劑盒和甘油三酯試劑盒，冰醋酸（分析純），無(wú)水乙醇，豬油（自制），豬膽鹽。

1.2 儀器與設(shè)備

B203LEDR生物顯微鏡，AC-0629普通光學(xué)顯微鏡，單人凈化工作臺(tái)，XW.80A旋渦混合器，DHP9080電熱恒溫培養(yǎng)箱，LS-C50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，分光光度計(jì)，冷凍離心機(jī)，pH計(jì)。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，檸檬酸二胺2 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，Tween-80 1 mL，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.0，在121℃滅菌20 min。

膽固醇（TC）培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱量0.1 g膽固醇于小燒杯，加入1 mL Tween-80，0.1 g蔗糖酯，攪拌均勻后加入5.0 mL冰乙酸，邊加熱邊攪拌至充分溶解，超聲處理15 min后再加入MRS培養(yǎng)基中，邊加邊攪拌，使膽固醇質(zhì)量濃度為0.1 g/L，然后加入0.2%巰基乙酸鈉，調(diào)pH值為6.0，121℃滅菌15 min。

甘油三酯（TG）培養(yǎng)基：將Tween-80與豬油按1∶5比例混合，邊加熱邊攪拌至充分溶解，保溫5 min后乳化，得到甘油三酯膠束。將6%的比例將甘油三酯膠束加入MRS培養(yǎng)基中，邊加邊攪拌，然后加入0.2%巰基乙酸鈉，調(diào)pH值為6.0，121℃滅菌15 min。

1.4 方法

1.4.1 菌株的活化

將五株乳桿菌按體積分?jǐn)?shù)為1%的比例接種到滅完菌的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，按相同的步驟再重復(fù)活化一次，備用。

1.4.2 菌株最適溫度的測(cè)定

將活化好的菌株按1%的比例接種到MRS培養(yǎng)基中，分別在33，35，37，39，41，43 ℃下培養(yǎng)24 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照，用分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)量OD值。

1.4.3 菌株最適pH值的測(cè)定

配制好培養(yǎng)基后分別將pH值調(diào)至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，將5種菌按1%的量接種到調(diào)好pH值的MRS培養(yǎng)基中，在最適溫度處培養(yǎng)24 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照，用分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)量OD值。

1.4.4 菌株生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸性能的測(cè)定

將活化好的菌株按1%的比例接種到MRS培養(yǎng)基中，最適溫度下培養(yǎng)24 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照，每隔2 h測(cè)量OD600值和pH值。

1.4.5 菌株對(duì)人工胃液的耐受能力

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的NaCl和0.35%胃蛋白酶加入燒杯中，用濃度為1 mol/L的HCL調(diào)整pH值為3.0后，使用0.22 μm的過(guò)濾器過(guò)濾除菌后備用。將活化好的菌種培養(yǎng)液離心，收集菌體，加入生理鹽水，使用漩渦混合器制菌懸液后以1∶9的比例與人工胃液混合，最適溫度下孵育3 h，以未孵育的菌種為對(duì)照，使用高層瓊脂柱法計(jì)數(shù)，計(jì)算菌種存活率，即

1.4.6 菌株對(duì)膽鹽的耐受能力

將不同濃度的豬膽鹽加入到MRS培養(yǎng)基中，按1%的量接種后最適溫度下培養(yǎng)48 h，以未加入膽鹽的培養(yǎng)基作為對(duì)照，用分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)量OD值。

1.4.7 菌株對(duì)TC的降解能力

將菌接種到膽固醇培養(yǎng)基后最適溫度下培養(yǎng)48 h，每隔6個(gè)小時(shí)測(cè)定TC降解量，以不含TC為對(duì)照，將培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min下離心10 min，用膽固醇試劑盒測(cè)定TC的量。

1.4.8 菌株對(duì)TG的降解能力

將菌接種到甘油三酯培養(yǎng)基后最適溫度下培養(yǎng)48 h，每隔6個(gè)小時(shí)測(cè)定TG降解量，以不含TG為對(duì)照，將培養(yǎng)基5 000 r/min離心10 min，用甘油三酯試劑盒測(cè)定TG的量。

1.4.9 降脂機(jī)制的初步探究

將菌接種到膽鹽高脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后取5 mL，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌3次后溶于pH值為7的磷酸鹽緩沖液，離心，測(cè)定上清液中TC和TG量A1。棄去此時(shí)上清液，加入無(wú)水乙醇超聲破碎，離心后搖勻，測(cè)定細(xì)胞破碎液中TC和TG量A2。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌基本特性的研究

2.1.1 菌株最適生長(zhǎng)溫度和pH值的測(cè)定

為了確定乳桿菌最適生長(zhǎng)條件，以pH值、溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，如圖1和圖2所示。

圖1 最適pH值的測(cè)定

圖2 最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定

由圖1和圖2可以看出，菌株在不同的pH值和溫度下生長(zhǎng)狀況都不同。5種菌的最適pH值均為6.0，而LP的最適生長(zhǎng)溫度為33℃，其余菌為37℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用最適條件培養(yǎng)乳桿菌。

2.1.2 菌株生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力的測(cè)定

在發(fā)酵產(chǎn)品中，乳桿菌利用葡萄糖或蔗糖產(chǎn)酸，使pH值下降。這不僅具有細(xì)菌學(xué)意義，而且能促進(jìn)產(chǎn)品的干燥速度。為了了解菌株生長(zhǎng)狀況及產(chǎn)酸性能，每隔2個(gè)小時(shí)測(cè)量OD600值，繪制5株菌的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線，如圖3和圖4所示。

圖3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

圖4 產(chǎn)酸能力的測(cè)定

由圖3和圖4可以看出，隨著時(shí)間的推移，菌株生長(zhǎng)速率及產(chǎn)酸速率也不同，LC和LP生長(zhǎng)速度較快，產(chǎn)酸能力也較強(qiáng)，20 h后，pH值已下降至3.81，之后OD值和pH值也變化很小，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)已進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。

2.1.3 菌株耐酸及耐膽鹽能力的測(cè)定

胃酸和膽汁鹽具有抗菌性，乳桿菌被食入后菌體必須通過(guò)胃液，同時(shí)還要能夠抵抗膽汁鹽。固菌種對(duì)胃酸及膽鹽的耐受性是衡量益生菌的重要指標(biāo)[6]。對(duì)五株菌進(jìn)行胃酸和膽鹽耐受性測(cè)試，結(jié)果如表1所示。

表1 乳桿菌耐酸耐膽鹽能力 %

由表1可以看出，5株菌均表現(xiàn)出了一定的益生功能，隨著膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，菌株存活率下降。在pH=3的人工胃液中，4種菌存活率均大于35%，其中，LGG和LA存活率分別為78.41%和66.02%；在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)，LC和LP存活率均大于30%；LC，LP和LGG在pH=3且膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的MRS培養(yǎng)基中存活率分別為40.28%，44.11%，21.27%。

2.2 菌株降脂性能的測(cè)定

分別對(duì)5種菌進(jìn)行體外膽固醇和甘油三酯降解實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膽鹽對(duì)菌株降解膽固醇的影響，結(jié)果如圖5～圖7所示。

由圖5和圖6可以看出，隨著時(shí)間的增加，菌株對(duì)膽固醇和甘油三酯的降解量逐漸增加。LB，LC，LGG降解膽固醇效果較好，分別為45.63%，48.13%，30.63%；LC降解甘油三酯效果較好，為23.06%。其中，LC對(duì)膽固醇和甘油三酯的降解能力顯著高于其他菌株，分別為45.60 mg/L和0.91 g/L。由圖7可知，當(dāng)加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽后，由于膽鹽的抑菌作用，4種菌對(duì)膽固醇的降解作用都顯著下降，但LP對(duì)膽固醇的降解作用反而增強(qiáng)，降解率從23.12%增加至31.25%，可能由于LP將膽鹽分解后，膽固醇合成膽鹽，從而促進(jìn)膽固醇的分解代謝，降低膽固醇質(zhì)量濃度。

一般認(rèn)為，能在pH=3的條件下存活2 h并能耐受0.1%膽鹽的乳桿菌就能順利通過(guò)胃和上段腸管到達(dá)下段腸管從而放大其生物學(xué)功效[7]。本研究將菌在pH=3的人工胃液孵育3 h，再在高脂培養(yǎng)基添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%膽鹽，培養(yǎng)后測(cè)定各菌株降脂能力，結(jié)果如表2所示。

表2 人工胃液孵育后的降脂能力

由表2可以看出，在模擬人體內(nèi)環(huán)境后，菌株對(duì)膽固醇和甘油三酯的降解能力表現(xiàn)出了明顯的菌株特異性，其中，LC和LP的降脂性能較好，對(duì)膽固醇和甘油三脂的降解量分別為20.00，22.00 mg/L和0.86，0.12 g/L。

2.3 菌株降脂機(jī)制

關(guān)于益生菌降解膽固醇的機(jī)理，學(xué)者們提出了不同的假說(shuō)，如膽鹽的脫結(jié)合，共沉淀，吸收等，甘油三酯的降解機(jī)制可能與膽固醇類似，但在國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)告較少[8-9]。本研究通過(guò)對(duì)可能發(fā)生的共沉淀和吸收機(jī)制的研究，初步探究乳桿菌的降脂機(jī)理，結(jié)果如表3所示。

表3 菌株降脂能力及共沉淀的測(cè)定

研究表明，當(dāng)pH值低于5.5時(shí)，膽固醇會(huì)隨著膽鹽一起沉淀下來(lái)，而此沉淀溶于pH值為7的磷酸鹽緩沖液。如表3所示，LB和LGG會(huì)使膽固醇和膽鹽發(fā)生共沉淀，前者還能吸附部分膽固醇至細(xì)胞內(nèi)，從而吸收利用膽固醇。在緩沖液中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)甘油三酯，但在離心的菌體上清液中含有甘油三酯，說(shuō)明LB和LC可能通過(guò)吸收或吸附的方式將甘油三酯利用。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)發(fā)酵食品是我國(guó)食品領(lǐng)域中的一個(gè)非常重要的組成部分，它因具有獨(dú)特的色、香、味而深受人們的喜愛(ài)。功能性食品是新時(shí)代對(duì)傳統(tǒng)食品深層次的要求。本研究從西北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵果蔬和乳品中分離篩選出5株乳桿菌，針對(duì)其益生方面進(jìn)行研究，加強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)品功能性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5株菌都展現(xiàn)出較好的益生功能，對(duì)人工胃液均有一定的適應(yīng)能力；通過(guò)降脂實(shí)驗(yàn)表明，不同菌株在降脂能力方面都表現(xiàn)出了菌株特異性，其降解機(jī)理上也表現(xiàn)出了菌株特異性，膽固醇降解效果最好的是LC，降解率為48.1%，最低是LA，降解率僅為4.8%，甘油三酯降解效果最好的是LC，降解率為23.06%，其余4株菌均低于5%；當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，LP對(duì)膽固醇的降解作用反而增強(qiáng)，其余4株菌降解作用都下降，可能由于LP將膽鹽分解后，膽固醇合成膽鹽，從而增加了對(duì)膽固醇的利用率；目前國(guó)內(nèi)外在乳桿菌利用甘油三酯方面的研究相對(duì)較少，本研究從甘油三酯降解機(jī)制上出發(fā)，發(fā)現(xiàn)乳桿菌在對(duì)甘油三酯的利用機(jī)制上可能與膽固醇利用機(jī)制類似，都是通過(guò)吸收或吸附方式，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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