焦月華，張爽，黃曉峰，姜波，趙良友，嚴妍，樸成玉

(1.黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，哈爾濱150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030；3.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150025)

0 引言

青貯飼料的質(zhì)量直接影響反芻動物的生產(chǎn)性能，而青貯飼料所用乳酸菌對其質(zhì)量起決定性作用，我國在青貯飼料用直投式乳酸菌發(fā)酵劑的研究與應(yīng)用方面十分薄弱。乳酸菌直投式發(fā)酵劑的制備通常采用真空冷凍干燥技術(shù)，在凍干過程中部分菌體細胞會受損甚至死亡[1]，使菌體細胞的發(fā)酵活力下降，凍干保護劑可有效減少菌體所受傷害。本研究以從青貯飼料中分離并篩選得到的1株用于青貯飼料制作的優(yōu)良植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp1）為研究對象，選取了4種公認保護效果較好的凍干保護劑[2-5]，采用單因素和正交試驗比較了不同的凍干保護劑對其菌體細胞凍干后存活率的影響，以期確定最佳的凍干保護劑配方，從而為青貯飼料用乳酸菌直投式發(fā)酵劑在畜牧行業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株來源

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）Lp1，本實驗室保存。分離自優(yōu)質(zhì)的青貯玉米飼料，經(jīng)前期實驗已初步確定具有較強的產(chǎn)酸能力和產(chǎn)酸速率，可用于制作青貯飼料。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

脫脂乳粉（進口），海藻糖，三聚磷酸鉀，抗壞血酸，葡萄糖，蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，Tween-80 1g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，檸檬酸氫二銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，蒸餾水1L，pH值為5.8～6.0，121℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器和設(shè)備

高速冷凍離心機（TGL-16G），培養(yǎng)箱（DHPP272），光學(xué)顯微鏡，超凈工作臺（VD-1320），CHRIST ALPHA 1-4型凍干機。

1.2 方法

1.2.1 菌體的活化與培養(yǎng)

將實驗室保存的植物乳桿菌Lp1接入到MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)，每24 h傳代一次，均按照體積分數(shù)為1.5%的接種量接種，活化兩次。隨后將活化后的菌液以體積分數(shù)為3%的接種量接種到100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期（14 h）后收集菌體。

1.2.2 濃縮發(fā)酵劑的制備和真空冷凍干燥

將植物乳桿菌Lp1的發(fā)酵液在4℃下，以6 000 g，離心20 min，在無菌操作臺中棄掉上清液，用滅菌生理鹽水洗滌菌泥2次，隨后用1/10原發(fā)酵液體積的滅菌生理鹽水充分懸浮混合菌體，接著4℃離心收集菌體，棄去上清液，然后加入等體積的不同濃度的凍干保護劑后充分震蕩，混勻菌懸液。將菌懸液樣品放置在-80℃預(yù)凍12 h后，放入真空冷凍干燥機中進行凍干，利用凍干后菌體細胞的存活率來比較凍干保護劑的效果。

1.2.3 菌體細胞存活率計算

采用梯度稀釋平板活菌計數(shù)法，分別對凍干前的菌懸液樣品和凍干后的樣品進行活菌計數(shù)，其中凍干后的菌粉計數(shù)時，先向凍干菌粉中加入與凍干前等體積的滅菌生理鹽水進行復(fù)水，隨后將平板在37℃下培養(yǎng)48 h后計活菌數(shù)，測定菌體細胞凍干存活率。

菌體細胞存活率=1mL凍干后樣品中的活菌數(shù)/1mL凍干前樣品中的活菌數(shù)×100%。

1.2.4 凍干保護劑單因素的確定

根據(jù)目前的研究進展，選取的4種保護劑的質(zhì)量濃度分別如下：海藻糖為10，20，40，60，80 g/L[3,6-7]；脫脂乳為10，50，100，150，200 g/L[2,4,7]；三聚磷酸鉀為5，10，15，20，25 g/L[5]；抗壞血酸為10，20，30，40，50 g/L[4-5,7]。

1.2.5 凍干保護劑的正交組合確定

根據(jù)單因素的變化趨勢，綜合考慮保護效果和成本因素，選出各因素最適宜的質(zhì)量濃度水平范圍，設(shè)計正交組合優(yōu)化凍干保護劑的復(fù)配，具體的因素水平如表1所示。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，并用Duncan's法進行多重比較，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示。

表1 因素水平編碼 g/L

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干保護劑的單因素實驗結(jié)果

圖1為凍干保護劑對凍干后菌體細胞存活率的影響。由圖1可以看出，與不添加任何凍干保護劑相比，所有凍干保護劑在凍干過程中對菌體細胞都具有不同程度的保護作用。其中，由圖1（a）可知脫脂乳質(zhì)量濃度選為50，100，150 g/L時保護效果較好；由圖1（b）可以看出，海藻糖質(zhì)量濃度為20，40，60 g/L和80 g/L時菌粉凍干存活率較高，由于考慮成本，所以選擇質(zhì)量濃度為20，40，60 g/L作為后續(xù)正交實驗的水平；由圖1（c）可以看出，三聚磷酸鉀的質(zhì)量濃度為10，15，20g/L時保護效果最佳；由圖1（d）可以看出，抗壞血酸質(zhì)量濃度為20，30，40 g/L時保護效果較好。

2.2 凍干保護劑的正交組合優(yōu)化實驗結(jié)果

比較圖1和表2可知，添加各單一凍干保護劑的乳酸菌在凍干后細胞的存活率在30.25%～70.43%，而添加正交實驗中9種復(fù)合凍干保護劑的乳酸菌菌體細胞的凍干存活率在71.45%～92.18%，表明復(fù)合凍干保護劑對乳酸菌菌體細胞的保護效果比單一凍干保護劑的保護效果好。

由表2可以看出，影響植物乳桿菌Lp1凍干后菌體細胞存活率的因素主次順序為B＞C＞D＞A，海藻糖的效果最明顯，三聚磷酸鉀次之，再次為抗壞血酸，影響最小的為脫脂乳，最佳保護劑配方為A2B2C3D2，但是優(yōu)化出的最優(yōu)組合未出現(xiàn)在正交實驗組，為了進一步確定正交實驗的準確性，在相同條件下，對A2B2C3D2組合與A2B3C1D2組合進行了一次驗證實驗。結(jié)果表明，植物乳桿菌Lp1菌體細胞的凍干存活率為95.47%，高于實驗組細胞存活率的最大值。因此確定A2B2C3D2為最佳的復(fù)合凍干保護劑組合，即脫脂乳100 g/L，海藻糖40 g/L，三聚磷酸鉀20 g/L，抗壞血酸30 g/L（均為質(zhì)量濃度）。

表2 因素水平編碼 g/L

圖1 對凍干后菌體細胞存活率的影響

3 討論

乳酸菌直投式發(fā)酵劑一般是通過真空冷凍干燥制備而成的，它具有活菌數(shù)高、菌體細胞活力強、不易被污染和易于運輸保藏等優(yōu)點。許多研究表明[2,5]，在乳酸菌的冷凍干燥過程中，若直接進行冷凍干燥，其死亡率將達90%以上，因此選擇合適的凍干保護劑至關(guān)重要，單一保護劑不能滿足菌體抵抗外界惡劣條件的要求[8]，本研究也證實了這一點，正交試驗中9種復(fù)合凍干保護劑對菌體細胞的保護效果全部都優(yōu)于各單一凍干保護劑的保護效果，而未添加凍干保護劑的植物乳桿菌菌體細胞在凍干后的死亡率接近96%。本研究選擇脫脂乳、海藻糖、三聚磷酸鉀和抗壞血酸作為保護劑，主要原因包括如下幾點。脫脂乳不管單獨使用還是與其他凍干保護劑混合使用均具有良好的保護作用，它在凍干過程中能使溶液呈過冷狀態(tài)[2]，抑制細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性失活，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)以降低細胞死亡率，另外，它含有大量的蛋白質(zhì)，能夠減少細胞暴露于氧氣和介質(zhì)中的表面積，給細胞提供了保護性的外衣，減少細胞壁損傷[9]。海藻糖在凍干過程中能擴散至胞內(nèi)并填充在胞內(nèi)酶和其他蛋白質(zhì)等活性大分子周圍，當細胞失水時，海藻糖的羥基可與胞內(nèi)的生物活性大分子的極性基團形成氫鍵，代替極性基團周圍失去的水分子，從而維持胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性[3]?？箟难岬牧u基能夠與乳酸菌菌體細胞壁中磷脂分子的磷酸基團之間形成氫鍵，從而抑制細胞膜因失水而受損。此外，抗壞血酸還能夠減少氧氣分子對凍干菌粉的氧化作用，如不添加抗壞血酸，則在儲存過程中，凍干菌粉會隨著水分活度的增加而發(fā)生褐變，從而導(dǎo)致顏色變深[10]。三聚磷酸鉀能夠在胞內(nèi)液中結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使胞內(nèi)液的粘性增加[5]，從而在凍干過程中弱化了水的結(jié)晶過程，降低了體系中水轉(zhuǎn)化成冰的比例，使其直接進入升華階段。

4 結(jié)論

通過單因素和正交試驗篩選出最佳的凍干保護劑配方為：脫脂奶粉100 g/L，海藻糖40 g/L，三聚磷酸鉀20 g/L，抗壞血酸30 g/L（均為質(zhì)量濃度）。，凍干后的發(fā)酵劑中菌體細胞的存活率為95.47%，對植物乳桿菌Lp1具有良好的保護效果，為青貯用直投式乳酸菌發(fā)酵劑的大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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