姜芳，李梅，王丹慧，宋娜娜，侯令芹，劉江梅，王丹

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（北京）有限責(zé)任公司，北京101107）

0 引言

鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素殘留通過食物鏈進(jìn)入人體后累積可以導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，因此，各國都對其作出限量要求，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號-2002動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量鏈霉素200 ng/mL、雙氫鏈霉素200 ng/mL、卡那霉素100 ng/mL。鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素殘留量的常規(guī)檢測方法主要有微生物法[1]、高效液相色譜技術(shù)[2-6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC－MS／MS）[7]、酶聯(lián)免疫吸附測定[8-11]等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程以及對檢驗(yàn)人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控大量樣本的篩查。本文的目的就是介紹快速靈敏地檢測牛奶中鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素殘留的方法--反競爭抑制免疫層析檢測法，該方法為定性檢測，其特點(diǎn)是簡單快速、特異敏感，并且同時(shí)出具多個(gè)結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料和設(shè)備

鮮奶樣,12%復(fù)原乳,生乳脂肪層的奶樣。

試劑：雙氧水,碳酸氫鈉,青霉素，糊精，三聚氰胺，氯化銨，深圳易瑞公司鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素二聯(lián)定性檢測試紙條。

儀器渦旋混合儀，加熱孵育器，單移液器（20-200 μL），多通道移液器（30～300 μL），讀數(shù)儀。

2 方法

2.1 干擾物質(zhì)的配制備

分別取不含目標(biāo)檢測物質(zhì)與含目標(biāo)檢測物質(zhì)的生乳做本底，分別制備出質(zhì)量濃度為20 mg/L雙氧水摻假樣品、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%碳酸氫鈉摻假樣品、100 μg/kg青霉素抗生素?fù)郊贅悠贰?.2%糊精摻假樣品、0.1%三聚氰胺摻假樣品、0.1%銨鹽摻假樣品。

2.2 具體檢測步驟

（1）調(diào)節(jié)溫育器溫度至40℃，并穩(wěn)定在（40±1）℃；

（2）實(shí)驗(yàn)前將試劑和樣品恢復(fù)至室溫；

（3）取出所需要數(shù)量的試劑微孔，吸取200 μL待測樣品于試劑微孔中，5～10次抽吸，混合均勻；

（4）迅速將試劑微孔置于溫育器中進(jìn)行第一步溫育，溫育溫度為（40±1）℃，時(shí)間為 3 min；

（5）第一步溫育結(jié)束后，取出所需數(shù)量試紙條,海綿端朝下,插入到微孔中開始第二步溫育，溫育溫度為（40±1）℃，時(shí)間為 6 min；

（6）第二步溫育結(jié)束后，從微孔中取出試紙條，輕輕刮去測試條下端的吸水海綿,利用讀數(shù)儀判讀結(jié)果（結(jié)果判讀必須在5 min內(nèi)完成）。

2.3 結(jié)果判定

讀數(shù)儀判讀結(jié)果：陰性為R＞1.1；陽性為R≤1.1。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢出限實(shí)驗(yàn)

對生乳樣品本底、檢出限點(diǎn)及檢出限附近點(diǎn)進(jìn)行檢測，每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行平行樣檢測，檢測結(jié)果如表1所示。

表1 鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素快速檢測試紙條檢出限實(shí)驗(yàn)對比結(jié)果

3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

使用二聯(lián)法、鏈霉素金標(biāo)快速檢測條法、卡那霉素素金標(biāo)快速檢測條法對原奶樣本進(jìn)行檢測，檢測點(diǎn)質(zhì)量濃度為生乳（空白實(shí)驗(yàn)）、120 ng/mL，2400 ng/mL每個(gè)點(diǎn)做10平行，符合率為100%。

3.3 干擾實(shí)驗(yàn)

3.3.1 陰性干擾

取不含目標(biāo)檢測物質(zhì)的生乳做本底，加入如下干擾物質(zhì)檢測，檢測情況如表2所示。

3.3.2 陽性干擾

取含目標(biāo)檢測物質(zhì)的樣品（生乳）做本底，二聯(lián)法、鏈霉素金標(biāo)快速檢測條法、卡那霉素素金標(biāo)快速檢測條法均對加標(biāo)質(zhì)量濃度為200 ng/mL的鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素的樣品進(jìn)行檢測,在制備的陽性樣本中加入干擾物質(zhì)，檢測結(jié)果如表3所示。

表2 鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素快速檢測試紙條陰性抗干擾性能對比結(jié)果

表3 試紙條陽性抗干擾性能對比結(jié)果

3.4 批量檢驗(yàn)結(jié)果

連續(xù)15日使用鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素快速檢測試紙條對生乳樣品進(jìn)行檢測，每天檢測20個(gè)生乳樣品，檢測過程中所用鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素快速檢測試紙條未出現(xiàn)失效、不走線等不良情況。

4 結(jié)論

由上述可以看出，鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素快速檢測反競爭抑制免疫層析檢測法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）在檢測過程中無需前處理，直接檢測，操作簡便；

（2）整個(gè)檢測過程用時(shí)9～10 min，用時(shí)短；

（3）對陰性生乳、陽性加標(biāo)樣品分別做了10次重復(fù)性檢測，檢測結(jié)果相同，重復(fù)性好。

（4）分別對陰性生乳、陽性加標(biāo)樣品做了8類物質(zhì)的抗干擾實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果一致，抗干擾能力強(qiáng)。

綜上所述，采用反競爭抑制免疫層析檢測法，微孔內(nèi)含鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素特異性抗體，試紙條檢測區(qū)T1包被卡那霉素抗原，T2包被鏈霉素&雙氫鏈霉素抗原，控制區(qū)（C）包被二抗，樣品中的鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素和試紙條上預(yù)包被的抗體，抑制抗原和鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素抗體的結(jié)合。對牛奶樣品中鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉

素做快速定性篩選。運(yùn)用此方法對生乳中鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素殘留量進(jìn)行篩選，與高效液相色譜技術(shù)、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC－MS／MS）、氮磷氣相色譜檢測法、薄層色譜、氣相色譜的檢測技術(shù)相比上述方法由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程以及對檢驗(yàn)人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控大量樣本的篩查，而此法樣本前處理簡單、儀器設(shè)備投資少，檢測成本低，可作為鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素藥物殘留快速篩選的首選方法。對于乳品企業(yè)，此法能夠保障到廠原奶及時(shí)出具檢測結(jié)果，且能夠滿足對到廠生乳及定容奶倉的定性篩選排查，可將儀器法作為此法的確認(rèn)法。

[1]GB／T 4789.27－2008，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)鮮乳中抗生素殘留檢驗(yàn)［S］.

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