劉少敏 ，周文琦，李婷，滿朝新，郭鸰，姜毓君，

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)a.食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點實驗室；b.黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，哈爾濱150030）

0 引言

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致機體衰老和與衰老相關(guān)疾病的根本原因[1,2]，不僅如此，它還可能引起多種疾病，如動脈粥樣硬化、高血脂、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退行性疾病、心腦血管疾病等[3,4]。因此，對氧化應(yīng)激的防治成為近年來的研究熱點。大量研究表明，乳酸菌具有多種益生功能，不僅能夠調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)，維持腸道菌群平衡，還具有一定的抗氧化能力，能夠清除腸道內(nèi)的活性氧分子，使機體內(nèi)活性氧分子保持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)[5-7]。

本研究選取三株乳酸菌作為研究對象，分別是目前研究最為廣泛的嗜酸乳桿菌NCFM（Lactobacillus aci?dophilus NCFM）、植物乳桿菌植物亞種模式菌株——植 物 乳 桿 菌 ATCC 14917（Lactobacillus plantarum ATCC 14917）、從內(nèi)蒙古通遼地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離而來、具有多種益生功能的植物乳桿菌NDC 75017（Lactobacillus plantarum NDC 75017），對三株乳酸菌清除自由基的能力進行了比較，并分析和比較其對受到氧化損傷的Caco-2細(xì)胞胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響，初步探究了乳酸菌抗氧化作用的機制。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)

菌株來源：嗜酸乳桿菌NCFM、植物乳桿菌ATCC 14917、植物乳桿菌NDC 75017均為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室保藏菌株。

三株乳酸菌均培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，傳3代后即為實驗菌株。6 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清液即為實驗所需發(fā)酵液；離心后的菌體用無菌PBS洗滌三次，6 000 r/min，4℃離心10 min，即為實驗所需菌體；將菌體在沸水浴中處理20 min，無菌PBS洗滌3次，6 000 r/min，4 ℃離心10 min，即為滅活菌體。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞購自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、質(zhì)量濃度100 μg/mL鏈霉素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%非必需氨基酸的高糖DMEM培養(yǎng)液中，在37℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 清除自由基實驗

1.3.1 羥自由基清除實驗[8]

將1 mL的鄰二氮菲（濃度0.75 mmol/L）、2 mL的PBS（pH=7.4）和1mL的FeSO4（濃度0.75 mmol/L）混合均勻，加入1 mL的H2O2（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.12%）后分別加入三株乳酸菌菌液及其發(fā)酵液，混合均勻后37℃靜置孵育90 min，在536 nm處測量吸光值。

羥自由基清除活性=（As-Ac）/（Ab-Ac）×100%，

式中：As為樣品組吸光值；Ac為對照組吸光值（包括鄰二氮菲、PBS、FeSO4和H2O2）；Ab為空白組吸光值（包括鄰二氮菲、PBS和FeSO4）。

1.3.2 超氧陰離子自由基清除實驗[9]

每1 mL反應(yīng)液中包含濃度為20 mmol/L的PBS（pH=7.4），濃度為50 μmol/L的NBT，75 μmol/L的NADH，15 μmol/L的PMS和50 μL的菌液或發(fā)酵液，在37℃條件下孵育5 min，560 nm處測量吸光值。

超氧陰離子自由基清除活性=[(As-Ac）/As]×100%，

式中：As為樣品組吸光值；Ac為對照組吸光值（用蒸餾水取代樣品）。下同。

1.3.3 DPPH自由基清除實驗[10]

將DPPH溶于甲醇溶液配制成濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液，取此溶液2 mL分別與1 mL四株乳酸菌菌液及其發(fā)酵液混合均勻，室溫避光孵育30 min，在517 nm處測量吸光值。

DPPH自由基清除活性=[(Ac-As）/Ac]×100%，

1.4 緩解Caco-2細(xì)胞氧化損傷能力評價

1.4.1 氧化損傷模型構(gòu)建

用MTT法[11]確定構(gòu)建氧化損傷模型所需H2O2濃度，具體操作如下：Caco-2細(xì)胞以每孔1×105的濃度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后開始實驗，用無血清無雙抗的 DMEM 配制濃度為0，25，50，100，150，200，250，500，1 000，2 000 μmol/L的H2O2，每孔加100 μL培養(yǎng)30 min，吸去H2O2，每孔加入20 μL的MTT溶液培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，在490 nm處測量各孔吸光值。

1.4.2 細(xì)胞分組

Caco-2細(xì)胞以每孔3×105的濃度接種于六孔板，連續(xù)培養(yǎng)18 d。實驗共分為9組，每組3個重復(fù)，具體分組如下，空白組；損傷組：根據(jù)2.4.1結(jié)果選擇出的最佳H2O2濃度，每孔加入3 mL濃度為500 μmol/L的H2O2，30 min后移除并清洗，DMEM繼續(xù)培養(yǎng)4 h；陽性對照組：氧化損傷過的細(xì)胞清洗后，每孔加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的Vc，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；NCFM組、L.p 14917組、L.p 75017組：氧化損傷過的細(xì)胞清洗后，每孔加入3 ml DMEM配制的活菌數(shù)為108mL-1的三種菌懸液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；滅活NCFM組、滅活L.p 14917組、滅活L.p75017組：氧化損傷過的細(xì)胞清洗后，每孔加入3 mL的DMEM配制的菌落數(shù)為108mL-1的三種滅活菌體的菌懸液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.4.3 抗氧化酶活性的測定

實驗結(jié)束后，用冷的無菌PBS迅速清洗3次，收集細(xì)胞，4℃條件下2 000 g離心10 min，棄上清，用1 mL冷PBS清洗，4℃條件下2 000 g離心10 min，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100充分混勻，4℃條件下4 000 g離心15 min，收集上清。分別測量不同處理組上清液SOD活性、GPx活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均為平行測三次的值，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 自由基清除能力

2.1.1 羥自由基清除能力

羥自由基能夠降解DNA、損傷細(xì)胞膜和多糖化合物，是最主要的能夠?qū)е轮|(zhì)過氧化和多種人體細(xì)胞損傷的自由基[12,13]，在本研究中，羥自由基來源于Fenton反應(yīng)。圖1為3株乳酸菌羥自由基清除活性。

圖1 3株乳酸菌羥自由基清除活性

由圖1可以看出，3株乳酸菌菌體及發(fā)酵液均有一定的羥自由基清除能力。其中菌體的羥自由基清除能力分別為NDC75017（79.87%±0.027）＞ATCC14917（69.74%±0.008）＞NCFM（65.17%±0.042），發(fā)酵液羥自由基清除能力分別為NDC75017（32.13%±0.017）＞ATCC14917（23.65% ± 0.025）＞NCFM（17.28% ±0.018）。分析其結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，在羥自由基清除活性方面3株乳酸菌菌體均大于發(fā)酵液，其中植物乳桿菌NDC75017表現(xiàn)出最強的羥自由基清除活性，乳酸菌菌體具有較強的羥自由基清除能力可歸結(jié)為在乳酸菌細(xì)胞內(nèi)存在著針對Cu2+和Fe2+的天然螯合物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠螯合Cu2+和Fe2+，從根本上減少羥自由基的產(chǎn)生[6]。

2.1.2 超氧陰離子自由基清除能力

由PMS/NADH組成的非酶促反應(yīng)系統(tǒng)可以產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基能夠?qū)BT還原成紫色的甲瓚，甲瓚在560 nm處具有最強的吸光值，在反應(yīng)過程中加入3株乳酸菌菌體或發(fā)酵液，通過吸光值的減少量可計算出超氧陰離子清除率。圖2為3株乳酸菌超氧陰離子自由基清除活性。

圖2 3株乳酸菌超氧陰離子自由基清除活性

由圖2可以看出，3株乳酸菌菌體超氧陰離子自由基清除率為NDC75017（39.45%±0.040）＞ATCC14917（23.63%±0.015）＞NCFM（15.25%±0.013），發(fā)酵液超氧陰離子自由基清除率為ATCC14917（63.62%±0.036） ＞NDC75017（51.83% ± 0.029） ＞NCFM（35.40%±0.031）。在超氧陰離子自由基清除活性方面3株乳酸菌發(fā)酵液均大于菌體，其中菌體方面植物乳桿菌NDC75017表現(xiàn)出最強的超氧陰離子自由基清除活性，發(fā)酵液方面植物乳桿菌ATCC14917的發(fā)酵液具有最強的超氧陰離子自由基清除能力。乳酸菌菌體及發(fā)酵液具有超氧陰離子自由基清除能力可能是由于其菌體細(xì)胞及代謝產(chǎn)物中存在SOD，有報道顯示，SOD、CAT、NADH氧化酶和NADH過氧化物酶等都存在于乳酸菌中，并且這些抗氧化酶是乳酸菌防御氧化應(yīng)激的重要酶促防御系統(tǒng)[14]。

2.1.3 DPPH自由基清除能力

目前，清除DPPH自由基實驗被廣泛應(yīng)用于抗氧化能力評價實驗中，其原理是，DPPH自由基含有單電子，在517 nm處有一強吸收，其醇溶液呈紫色，當(dāng)有自由基清除物質(zhì)存在時，自由基清除物質(zhì)會提供H+與DPPH中單電子對配對而使DPPH醇溶液褪色，吸光值也降低。圖3為3株乳酸菌DPPH自由基清除活性。

圖3 三株乳酸菌DPPH自由基清除活性

由圖3可以看出，3株乳酸菌菌體DPPH自由基清除率為 ATCC14917（16.55%±0.016）＞NDC75017（13.32%±0.017）＞NCFM（5.99%±0.002），發(fā)酵液DPPH自由基清除率為NDC75017（55.13%±0.032）＞ATCC14917（38.02% ± 0.015）＞NCFM（22.55% ±0.018）。在DPPH自由基清除活性方面3株乳酸菌發(fā)酵液均大于菌體，其中菌體方面植物乳桿菌ATCC14917表現(xiàn)出最強的DPPH自由基清除活性，發(fā)酵液方面植物乳桿菌NDC75017的發(fā)酵液具有最強的DPPH自由基清除能力。有報道顯示，乳酸菌具有DPPH自由基清除活性可能和菌體產(chǎn)生的胞外多糖有關(guān)，Xu等[15]的研究顯示DPPH自由基的清除活性與由雙歧桿菌分離出的胞外多糖的濃度呈正相關(guān)。

2.2 緩解Caco-2細(xì)胞氧化損傷能力評價

2.2.1 過氧化氫濃度的選擇

為構(gòu)建合理的氧化損傷模型需要對H2O2的濃度進行選擇，本研究選擇0，25，50，100，150，200，250，500，1000，2000 μmol/L的 H2O2，與Caco-2細(xì)胞分別接觸30 min和1 h后，測定細(xì)胞存活率。圖4為過氧化氫濃度與細(xì)胞存活率關(guān)系。

圖4 過氧化氫濃度與細(xì)胞存活率關(guān)系

由圖4可以看出，過氧化氫與細(xì)胞生長狀態(tài)之間存在著一定的關(guān)系，與H2O2接觸后Caco-2細(xì)胞活性呈現(xiàn)先略微上升后急速下降的趨勢，這與楊瑞華[16]等研究所稱低濃度的過氧化氫可刺激細(xì)胞增殖這一結(jié)論相吻合。Wijeratne[18]等研究顯示，構(gòu)建氧化損傷模型的原則為僅讓細(xì)胞處于氧化損傷的環(huán)境下，使細(xì)胞做出氧化損傷應(yīng)答，但并不會導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞存活率大約維持在95%左右為宜。目前大量研究顯示，當(dāng)Caco-2細(xì)胞接觸的H2O2濃度＞500 μmol/L，時間長于1 h則會引起細(xì)胞死亡或脫壁，因此根據(jù)本實驗結(jié)果及參考文獻，最終選擇H2O2濃度為500 μmol/L，處理時間為30 min。

2.2.2 抗氧化酶活性的測定

表1 不同處理組抗氧化酶活性

如表1所示，SOD活性方面，與空白組相比，氧化損傷組SOD活性顯著降低，說明Caco-2細(xì)胞已受到氧化損傷，Wijeratne等[17]研究顯示當(dāng)Caco-2細(xì)胞處于不同濃度H2O2的條件下，隨著H2O2濃度的升高，Caco-2細(xì)胞胞內(nèi)SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)細(xì)胞處于氧化環(huán)境下，首先通過增加胞內(nèi)SOD的活性來緩解其受到的氧化損傷，當(dāng)氧化物的濃度達到一定值時將會對細(xì)胞造成損傷，SOD的活性也因此受到損傷因此而顯著下降。與損傷組相比，3株乳酸菌活菌處理組SOD活性均顯著升高，且L.p14917組和L.p75017組已與空白組沒有顯著差別；但3株乳酸菌滅活菌體組SOD活性變化均不顯著。

GPx活性方面，與空白組相比，氧化損傷組GPx活性顯著升高，說明Caco-2細(xì)胞在低濃度H2O2環(huán)境中也會呈現(xiàn)GPx活性上升的趨勢，以緩解其受到的氧化損傷。與損傷組相比，3株乳酸菌活菌處理組GPx活性均顯著下降，其中以L.p75017組效果最為明顯，GPx活性恢復(fù)到與空白組沒有顯著差異，其次是L.p 14917組，最后為NCFM組；但3株乳酸菌滅活菌體組GPx活性變化均不顯著。

3 結(jié)果與討論

自由基清除能力是評價物質(zhì)抗氧化能力的重要指標(biāo)，目前大量研究顯示乳酸菌發(fā)揮抗氧化作用與其具有自由基清除能力密切相關(guān)[18]。Deeplina等由發(fā)酵乳飲料中分離出1株具有抗氧化活性和高產(chǎn)GABA的植物乳桿菌DM5，并通過清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基等實驗證實了其具有較強的抗氧化能力[9]。Takashi等自魚腸道及發(fā)酵魚中分離出了75株乳酸菌，通過DPPH自由基清除實驗、超氧陰離子自由基清除實驗及Fe還原能力實驗，從中篩選出了6株具有較強抗氧化活性的菌株，其中4株為植物乳桿菌，1株為戊糖片球菌，1株為乳酸乳球菌[19]。本研究也對3株乳酸菌的自由基清除能力進行了比較，由實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3株乳酸菌的菌體及發(fā)酵液中，菌體的羥自由基清除率要優(yōu)于發(fā)酵液，而發(fā)酵液的DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除能力要優(yōu)于菌體；植物乳桿菌NDC 75017菌體具有最強的羥自由基清除能力；植物乳桿菌NDC 75017的發(fā)酵液具有最強的DPPH自由基清除能力，植物乳桿菌ATCC 14917發(fā)酵液具有最強的超氧陰離子自由基清除能力。因此，乳酸菌菌體自身的成分以及發(fā)酵液中的部分代謝產(chǎn)物能夠起到清除自由基的作用，不同菌株清除自由基的活性成分不同且清除能力也不同，它們能夠清除機體多余的自由基，防止自由基對機體細(xì)胞造成損傷，這也是乳酸菌發(fā)揮抗氧化作用的機制之一。

另一方面，抗氧化酶也是發(fā)揮抗氧化作用的重要重要物質(zhì)，它們普遍存在于機體各個細(xì)胞內(nèi)，主要包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，當(dāng)機體受到外界不良環(huán)境的刺激，抗氧化酶就會做出相應(yīng)的應(yīng)答[20]。Gao等分析了一株植物乳桿菌FC225的抗氧化機制，證實了其能夠顯著提升高血脂小鼠肝細(xì)胞中SOD和GPx活性，降低肝細(xì)胞中丙二醛（MDA）的含量；接著又從細(xì)胞通路角度證實其發(fā)揮抗氧化作用可能與提高Nrf2基因表達量有關(guān)[10]。李盛鈺等發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌C88在活菌數(shù)達1011mL-1濃度下，能夠顯著提高受到氧化損傷的Caco-2細(xì)胞細(xì)胞裂解液中GPx活性、SOD活性、羥自由基清除率和總抗氧化（T-AOC）能力，對由H2O2誘導(dǎo)引起的Caco-2細(xì)胞氧化損傷起到一定的保護作用[21]。本研究證實了3株乳酸菌活菌能夠不同程度的緩解由H2O2所造成的Caco-2細(xì)胞氧化損傷，尤其是植物乳桿菌NDC 75017具有最為顯著的緩解SOD活性降低及GPx活性激增的效果，可能是菌體產(chǎn)生的胞外多糖及多種代謝產(chǎn)物起到了一定的抗氧化作用，但3株乳酸菌滅活菌體對Caco-2細(xì)胞氧化損傷的緩解作用并不明顯，可能是在滅活過程中抗氧化成分也隨之失效。

綜上所述，植物乳桿菌NDC 75017在清除自由基和緩解由H2O2誘導(dǎo)引起的Caco-2細(xì)胞氧化損傷方面均具有顯著效果，是一株具有較強抗氧化功能的菌株。

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