蘇 欣， 沈 立， 張 宇

（1.白城職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林白城 137000；2．吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062）

二十二碳六烯酸（DHA，22：6n-3）是 Omega-3多不飽和脂肪酸（PUFAs）的一種，哺乳動(dòng)物自身不能合成，因此，組織和循環(huán)系統(tǒng)中的DHA主要來源于飲食攝取。魚類是提供DHA的主要食品來源，少量α-亞麻酸 （ALA）也可以轉(zhuǎn)化為DHA（Dariush 和 Jason，2011）。 研究表明，DHA 能夠影響多種疾病進(jìn)程，包括糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、高血壓、關(guān)節(jié)炎和非酒精性脂肪肝等（Hemant等，2011），有益于人類健康。

慢性炎癥可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如心血管疾病、代謝疾病、癌癥及病毒性疾病。大量研究表明，DHA可以預(yù)防炎癥誘導(dǎo)型疾病的發(fā)生（Howard 和 Dennis，2002；Lisa 和 Zena，2002）。細(xì)胞水平試驗(yàn)也證明，DHA抑制促炎轉(zhuǎn)錄因子NFκB的活性，抑制促炎因子 IL-6、TNF-α和MCP-1的表達(dá)和分泌 （Kumar等，2012；Jia等，2006），從而影響免疫反應(yīng)；DHA還可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活而抑制炎癥和代謝紊亂（Yan 和 Jiang，2013）。

豬與人類的基因組大小和組成非常相近，并且豬與人類的器官大小、循環(huán)系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)極為相似（Lynsey等，2011）。因此，豬不僅可以作為人類的食品，還是研究某些疾病的理想模型。本研究采用熒光定量PCR和Elisa方法觀察不同濃度DHA對(duì)豬血液?jiǎn)魏思?xì)胞（PPBMCs）炎癥的影響，為深入研究DHA對(duì)動(dòng)物和人類健康的保護(hù)作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 淋巴細(xì)胞分層液Histopaque?-1077（Sigma-Aldrich）、LPS、（Sigma-Aldrich）、DHA（Sigma-Aldrich）、Elisa 試劑盒 （武漢博士德）、實(shí)時(shí)熒光定量試劑 （北京天根）、RPMI1640（Hyclone）、FBS（invitrogen）。

1.2 豬血液?jiǎn)魏思?xì)胞分離 使用血液抗凝管收集（EDTA-2Na）豬外周血，每次收集 10 mL，按照Histopaque?-1077說明書，進(jìn)行單核細(xì)胞分離，最后用RPMI1640培養(yǎng)液重懸單核細(xì)胞，放至培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 豬血液?jiǎn)魏思?xì)胞于含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)，次日使用。每次均使用新鮮分離的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)照組加入DMSO，DHA使用3個(gè)濃度（5、10、20 μmol/L），每個(gè)濃度為一個(gè)處理組，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)，單獨(dú)孵育細(xì)胞24 h，進(jìn)行炎癥因子檢測(cè)。LPS使用常規(guī)濃度（1 μg/mL），處理 1 h后加入DHA進(jìn)行共孵育，24 h后進(jìn)行炎癥因子檢測(cè)。

1.4 CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè) 將細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，以104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，12 h后加入不同濃度 DHA（5、10、20 μmol/L）進(jìn)行孵育，每個(gè)處理組5個(gè)重復(fù)，12 h后加入CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，最后使用酶標(biāo)儀在450 nm處進(jìn)行測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各處理組與對(duì)照組之間使用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 DHA對(duì)PPBMCs活力的影響 由圖1可見，使用5 μmol/L和10 μmol/L DHA分別處理PPBMCs 12 h和24 h，對(duì)細(xì)胞活力沒有顯著影響，但20 μmol/L處理24 h時(shí)，細(xì)胞活力顯著下降。因此選擇5 μmol/L和10 μmol/L DHA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 CCK-8檢測(cè)PPBMCs活力

2.2 DHA對(duì)PPBMCs炎癥的影響 使用不同濃度 DHA（5 μmol/L 和 10 μmol/L）分別孵育 PPBMCs，在 12 h 和 24 h 分 別 檢 測(cè) IL-6、TNF-a 和MCP-1的mRNA水平和分泌濃度。結(jié)果顯示，DHA呈濃度依賴性抑制PPBMCs中IL-6、TNF-a和 MCP-1的表達(dá)和分泌（圖 2a、b）。

圖2 DHA對(duì)炎癥因子表達(dá)和分泌的影響

2.3 DHA對(duì)LPS誘導(dǎo)的PPBMCs炎癥的影響用1 μg/mL LPS孵育1 h，然后用不同濃度DHA處理 24 h，檢測(cè) IL-6、TNF-a和 MCP-1的 mRNA水平和分泌濃度。結(jié)果顯示，LPS上調(diào)PPBMCs炎癥水平，而DHA能夠抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥升高（圖 3a、b）。

3 討論

多不飽和脂肪酸是指碳鏈長(zhǎng)度為18～22個(gè)碳原子并含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵的直鏈脂肪酸，根據(jù)雙鍵的位置不同通常分為ω3和ω6。ω3-PUFAs主要包括DHA、二十碳五烯酸 （EPA）和ALA（Hemant等，2011）。 小鼠體內(nèi)體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，DHA可以轉(zhuǎn)化為脂蛋白類，存在于脂肪組織，還可作為細(xì)胞膜的磷脂成分，而在血液中DHA還能以非酯化的游離脂肪酸形式與白蛋白相結(jié)合。大量臨床數(shù)據(jù)顯示，DHA保護(hù)心血管健康和代謝平衡。DHA的長(zhǎng)期攝入伴隨著體內(nèi)炎癥和甘油三酯水平降低，因此，研究推測(cè)DHA的保護(hù)作用主要是通過影響體內(nèi)炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，并且在人類細(xì)胞系和小鼠體內(nèi)也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

圖3 檢測(cè)DHA對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)和分泌的影響

本研究中，不同濃度DHA對(duì)原代豬血液?jiǎn)魏思?xì)胞基礎(chǔ)水平的炎癥具有抑制作用，并且能夠抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。因此，本研究為深入研究DHA在豬體內(nèi)的抗炎作用提供了理論依據(jù)。

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