粟子丹，史成銀，劉江春，王勝?gòu)?qiáng)

（1．農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3．萊州明波水產(chǎn)有限公司，山東萊州 261418）

魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒納米探針的制備與特征分析

粟子丹1，2，史成銀1，劉江春3，王勝?gòu)?qiáng)1，2

（1．農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3．萊州明波水產(chǎn)有限公司，山東萊州 261418）

為了快速檢測(cè)魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒，本研究設(shè)計(jì)了病毒特異性的發(fā)夾型探針，經(jīng)硫醇修飾后與納米銀溶膠結(jié)合，制備了魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒納米探針（Ag-NNV），并使用透射電鏡、多功能酶標(biāo)儀、表面增強(qiáng)拉曼光譜儀等對(duì)納米探針Ag-NNV的表征及發(fā)夾型探針在納米銀粒子表面的覆蓋率進(jìn)行了測(cè)定和分析。結(jié)果表明，裸露的納米銀粒子為球形，平均直徑50 nm；制備的納米探針顆粒為球形，平均直徑90 nm。納米銀粒子和納米探針在溶液中均具有良好的分散性。平均每個(gè)納米銀粒子表面結(jié)合發(fā)夾型探針約100條，單位表面積的探針覆蓋量為0.56 pmol/cm2。該納米探針制備簡(jiǎn)便，適合用于表面增強(qiáng)拉曼散射法對(duì)魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒進(jìn)行快速檢測(cè)。

納米探針；神經(jīng)壞死病毒；表面增強(qiáng)拉曼散射

魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒（nervous necrosis virus，NNV）是單鏈RNA病毒，屬于野田村病毒科（Nodaviridae）乙型野田村病毒屬（Betanodavirus）。該病毒是魚(yú)類(lèi)病毒性神經(jīng)壞死病的病原，能夠引起魚(yú)苗的大量死亡[1]。其分布范圍廣泛，在亞洲、歐洲、澳洲、北美洲等地都有該病毒流行的報(bào)道。檢測(cè)魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒已有酶聯(lián)反應(yīng)吸附實(shí)驗(yàn)法、熒光抗體法、RT-PCR法等[2]，但這些方法樣品制備復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不適合于該病毒的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

近年來(lái)，一種無(wú)須樣品制備，可實(shí)時(shí)、原位、快速檢測(cè)病原微生物和生物大分子的表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）技術(shù)，在疾病診斷和生物分析領(lǐng)域獲得越來(lái)越多的應(yīng)用。其中基于納米銀顆粒的SERS納

米探針技術(shù)已被成功用于基因檢測(cè)的研究[3]和人類(lèi)病毒感染的檢測(cè)[4]，其檢測(cè)極限能達(dá)到0.5 fM的DNA模板[5]。但是還沒(méi)有此技術(shù)用于動(dòng)物及水產(chǎn)病原檢測(cè)的報(bào)道。

本研究制備了納米銀溶膠，將其與硫醇修飾的病毒特異性的發(fā)夾型探針偶聯(lián)，制作成可用于檢測(cè)魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒的SERS納米探針，并對(duì)其表征進(jìn)行了測(cè)量分析，為建立魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒的SERS快速檢測(cè)法打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器設(shè)備

鹽酸羥胺、硝酸銀購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，6-巰基-1-己醇購(gòu)自百靈威科技有限公司，氯化鎂、氫氧化鈉、氯化鈉購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)，Tris-HCl（pH 8.0）購(gòu)自北京索萊寶公司。主要儀器為T(mén)hermo Scientific公司的全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，德國(guó)IKA公司的C -MAGHS4磁力攪拌器和英國(guó)Renishaw公司的激光共聚焦拉曼光譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 神經(jīng)壞死病毒特異性的發(fā)夾型探針設(shè)計(jì)。選擇魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒RNA2基因序列（Genbank登錄號(hào)為KJ541748.2）的特異性區(qū)段，使用軟件Beacon Designer 7.9設(shè)計(jì)發(fā)夾型探針，在探針的5'端用巰基進(jìn)行修飾，在探針的3'端用Cy3標(biāo)記。探針序列為：5'-dithiol-A（5）CGCATCGTAGTCAATGGACAGCGGACGGATGCG-Cy3-3'。下劃線部分是探針的臂端，中間部分為魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒的特異性序列，構(gòu)成探針的環(huán)區(qū)。探針由大連寶生物公司合成。

1.2.2 納米銀溶膠的制備與特征分析。納米銀溶膠的制備參考Leopold等人[6]的鹽酸羥氨還原法。具體做法是：將10 ml 20 mM的硝酸銀溶液迅速倒入90 mL含有1.67 mM的鹽酸羥胺和3.3 mM 氫氧化鈉的混合液中，同時(shí)磁力攪拌。制得的納米銀溶膠的光學(xué)特征采用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀掃描300～700 nm的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜。其結(jié)構(gòu)和表面形貌特征用透射電子顯微鏡觀察，并測(cè)量納米銀顆粒的平均直徑。

1.2.3 納米銀溶膠的穩(wěn)定性分析。將制得的納米銀溶膠分為兩組，一組置于室溫下，另一組置于4℃冰箱中，均避光保存。在2個(gè)月內(nèi)持續(xù)取樣，測(cè)量各組溶膠的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜和pH值，分析其穩(wěn)定性。

1.2.4 納米探針的制備與特征分析。魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒納米探針（Ag-NNV）的制備參考Wang等人[7]的方法并略有改動(dòng)。將1 μM巰基化的發(fā)夾型探針和1 mM的MgCl2溶液充分混勻，室溫避光條件下靜置5 h左右。加入等體積的納米銀溶膠，混勻，在搖床上輕微搖晃1 d，加入少量NaCl溶液，使其終濃度為5 mM，靜置1 d。重復(fù)3次加NaCl溶液的過(guò)程。然后加入6-巰基-1-己醇使其終濃度為1 mM，混勻靜置10 min，以置換掉非特異結(jié)合的發(fā)夾型探針。最后13 400 r/m離心15 min，取沉淀用20 mM Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液重新懸浮。離心過(guò)程重復(fù)三次。采用1.2.2的方法分析納米探針Ag-NNV的特征。

1.2.5 納米銀粒子上NNV發(fā)夾型探針的載量測(cè)定。使用Demers等人[8]的配體交換法測(cè)定納米銀顆粒上NNV發(fā)夾型探針的結(jié)合量。取制備好的納米探針Ag-NNV，加入巰基乙醇使其終濃度為1 mM，混勻靜置24 h，將結(jié)合于納米銀顆粒上的NNV發(fā)夾型探針置換出來(lái)。然后13 400 r/m離心15 min，取上清液，測(cè)量其熒光值。依據(jù)Cy3標(biāo)記的寡核苷酸含量與熒光值的回歸方程，計(jì)算出結(jié)合在納米銀顆粒上的NNV發(fā)夾型探針的摩爾數(shù)。再用納米探針Ag-NNV的吸光度和摩爾吸光系數(shù)7.1ⅹ108cm-1M-1，計(jì)算出納米探針Ag-NNV中納米銀粒子的摩爾數(shù)[9]。依據(jù)上述兩個(gè)數(shù)據(jù)，最后計(jì)算出結(jié)合在每個(gè)納米銀粒子上的NNV發(fā)夾型探針的平均數(shù)量。

1.2.6 納米探針Ag-NNV的拉曼光譜測(cè)定。拉曼光譜儀采用532 nm激發(fā)波長(zhǎng)，氦氖激光器激光輸出功率50 mW。納米探針Ag-NNV溶液放在毛細(xì)玻璃管中，40倍的顯微鏡物鏡聚焦到樣品溶液中。使用1 800 groove/mm全息光柵，拉曼光譜積分時(shí)間為10 s。

2 結(jié)果

2.1 納米銀溶膠的表征及穩(wěn)定性

本研究制備的納米銀溶膠呈褐綠色，pH值在7.0左右。在透射電子顯微鏡下觀察可見(jiàn)：裸露的納米銀顆粒為球形，直徑約50 nm（圖1a）。300～700 nm紫外-可見(jiàn)光吸收光譜顯示，納米銀溶膠在412 nm處有最大吸收峰，最大吸收波長(zhǎng)半高寬小于100 nm，表明納米銀溶膠的分散性良好（圖2）。

圖1 透射電鏡下裸露的納米銀顆粒及制備的納米探針Ag-NNV（標(biāo)尺 = 50 nm）

圖2 納米銀溶膠及納米探針Ag-NNV的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜

在室溫和4℃保存的納米銀溶膠，在兩個(gè)月內(nèi)均能保持相對(duì)穩(wěn)定，pH值基本沒(méi)有變化（圖3）。300～700 nm紫外-可見(jiàn)光吸收光譜也一直保持相似的譜型，最大吸收波長(zhǎng)保持不變，但最大吸光度隨時(shí)間的推移而緩慢下降。其中，在剛制備好的一個(gè)星期內(nèi)下降較快，隨后的下降比較平緩。與常溫保存比較，4℃保存時(shí)，納米銀溶膠的最大吸光度下降更加緩慢（圖4）。

2.2 納米探針Ag-NNV的表征分析

將NNV發(fā)夾型探針和納米銀溶膠結(jié)合孵育后，巰基和納米銀表面形成Ag-S鍵，制作出了納米探針Ag-NNV。結(jié)合前后溶膠的顏色沒(méi)有明顯變化。電鏡觀察測(cè)量，納米探針Ag-NNV的平均直徑為90 nm，比裸露的納米銀粒子大了約40 nm；納米探針表面相對(duì)比較光滑（圖1b）。在300～700 nm紫外-可見(jiàn)光吸收光譜上，納米探針Ag-NNV的最大吸收波長(zhǎng)為416 nm，最大吸收波長(zhǎng)半高寬小于100 nm。與結(jié)合發(fā)夾型探針前的納米銀溶膠相比，其最大吸收波長(zhǎng)向右漂移4 nm（圖2），表明NNV發(fā)夾型探針已經(jīng)結(jié)合到了納米銀粒子上。

圖3 制備后2個(gè)月內(nèi)納米銀溶膠pH值的變動(dòng)情況

圖4 制備后2個(gè)月內(nèi)納米銀溶膠最大吸光度的變動(dòng)情況

2.3 納米銀粒子表面NNV發(fā)夾型探針的載量

建立的Cy3標(biāo)記的寡核苷酸濃度與熒光值的回歸方程為y=248.58x+0.14（R2= 0.992 1），其中y代表熒光值，x代表寡核苷酸濃度（μM）。通過(guò)全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀測(cè)得上清中熒光含量為45.92，由此計(jì)算出納米銀粒子表面結(jié)合的NNV發(fā)夾型探針的摩爾濃度為0.184 1 μM。根據(jù)納米銀粒子的摩爾濃度0.001 85 μM及其平均直徑50 nm，可計(jì)算出平均每個(gè)納米銀粒子表面結(jié)合發(fā)夾型探針約100條，納米銀粒子單位表面積的探針覆蓋量為0.56 pmol/cm2。

2.4 納米探針Ag-NNV的拉曼光譜

根據(jù)測(cè)定，納米探針Ag-NNV的拉曼光譜特征峰主要有：729 cm-1、949 cm-1、1096 cm-1、1281 cm-1、1377 cm-1、1 067cm-1，其中1 096 cm-1是嘌呤A的特征峰（圖5）。

圖5 納米探針Ag-NNV的拉曼光譜圖

3 討論

試驗(yàn)表明，納米銀溶膠在4℃和常溫下都能保持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定，可用于制備納米探針。其中納米銀溶膠在4℃的穩(wěn)定性要強(qiáng)于在常溫的穩(wěn)定性，建議銀溶膠避光保存在4℃的條件。與文獻(xiàn)中提及的保存條件一致[4，10]。與結(jié)合NNV發(fā)夾型探針前的納米銀溶膠相比，納米探針Ag-NNV的最大吸光度下降了0.5 左右，說(shuō)明在制備納米探針的過(guò)程中納米銀粒子有損失，原因可能是離心過(guò)程中離心管表面吸附了一些納米銀粒子，需要在操作中盡量克服。

本研究制備的納米探針，平均每個(gè)納米銀粒子表面結(jié)合發(fā)夾型探針約100條，比Wang等人[4]報(bào)道的發(fā)夾型探針結(jié)合數(shù)量（90條）稍多，更適合用于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)探針信號(hào)。有研究表明[11]，在一定范圍內(nèi)，增加寡核苷酸探針的使用量，可以增加納米銀粒子表面結(jié)合的探針數(shù)量。

本實(shí)驗(yàn)成功制備出納米探針Ag-NNV，對(duì)其表征測(cè)量分析表明，該納米探針生物學(xué)性能良好，可用于SERS法檢測(cè)魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒。本研究為應(yīng)用納米探針技術(shù)檢測(cè)水生動(dòng)物病原做了有益的探索，基于納米探針的檢測(cè)技術(shù)有望成為一種快速檢測(cè)水產(chǎn)病原微生物的方法。

[1] Munday B L，Kwang J，Moody N. Betanodavirus infections of teleost fish：a review[J]. Journal of Fish Diseases，2002，25（3）：127-142.

[2] Shetty M，Maiti B，Santhosh K S，et al. Betanodavirus of marine and freshwater fish：distribution，genomic organization，diagnosis and control measures[J]. Indian Journal of Virology，2012，23（2）：114-123.

[3] Mckenzie F，Graham D. Controlled assembly of SERRS active oligonucleotide–nanoparticle conjugates[J]. Chem. Commun.，2009（38）：5757-5759.

[4] Wang H，F(xiàn)ales A M，Zaas A K，et al. Surface-enhanced Raman scattering molecular sentinel nanoprobes for viral infection diagnostics[J]. Analytica Chimica Acta，2013，786：153-158.

[5] Faulds K，Smith W E，Graham D. Evaluation of surfaceenhanced resonance Raman scattering for quantitative DNA analysis[J]. Anal Chem，2004，76（2）：412-417.

[6] Leopold N，Lendl B. A New Method for Fast Preparation of Highly Surface-Enhanced Raman Scattering（SERS）Active Silver Colloids at Room Temperature by Reduction of Silver Nitrate with Hydroxylamine Hydrochloride[J]. The Journal of Physical Chemistry B，2003，107（24）：5723-5727.

[7] Wang H，Vo-Dinh T. Multiplex detection of breast cancer biomarkers using plasmonic molecular sentinel nanoprobes[J]. Nanotechnology，2009，20（6）：65101.

[8] Demers L M，Mirkin C A，Mucic R C，et al. A fluorescence-based method for determining the surface coverage and hybridization efficiency of thiol-capped oligonucleotides bound to gold thin films and nanoparticles[J]. Anal Chem，2000，72（22）：5535-5541.

[9] Lee J S，Lytton-Jean A K，Hurst S J，et al. Silver nanoparticle-oligonucleotide conjugates based on DNA with triple cyclic disulfide moieties[J]. Nano Lett，2007，7（7）：2112-2115.

[10] 楊生春，唐春，董守安，等. 基于納米Ag粒子的表面等離子體共振光譜測(cè)定CN-的研究[J]. 分析試驗(yàn)室，2005（1）：55-58.

[11] Vidal Jr B C，Deivaraj T C，Yang J，et al. Stability and hybridization-driven aggregation of silver nanoparticle–oligonucleotide conjugates[J]. New Journal of Chemistry，2005，29（6）：812.

Production and Characterization of Silver Nanoprobe for Detection of Fish Nervous Necrosis Virus

Su Zidan1，2，Shi Chengyin1，Liu Jiangchun3，Wang Shengqiang1，2
（1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries，Ministry of Agriculture，Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao，Shandong 266071；2. College of Fisheries and Life Science，
Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；3. Laizhou Mingbo Aquatic Company Ltd.，Laizhou，Shandong 261418）

A nanoprobe（Ag-NNV）was prepared and characterized for detecting fish nervous necrosis virus. The morphology and spectroscopic properties of Ag-NNV nanoprobe were evaluated by transmission electron microscopy，automatic microplate reader and surface-enhanced Raman microscope. The results showed that the Ag-NNV nanoprobe was sphere-shaped with average diameter of 90 nm and dispersed well in the solution. The number of hairpin probe attached on a silver nanoparticle was estimated to be about 100 and the coverage density was 0.56pmol/cm2. With easy preparation，the Ag-NNV nanoprobe can be used for quick detection of fish nervous necrosis virus by surface enhanced Raman scattering.

nanoprobe；nervous necrosis virus；surface-enhanced Raman scattering（SERS）

S941

A

1005-944X（2015）06-0075-04

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD17B01）

史成銀