屈素潔，鄒聯(lián)斌，陳芳芳，張步嫻，胡 杰，莫?jiǎng)偬m，施開創(chuàng)，李 軍，尹彥文

（廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001）

應(yīng)用熒光定量RT-PCR檢測J亞群禽白血病病毒

屈素潔，鄒聯(lián)斌，陳芳芳，張步嫻，胡 杰，莫?jiǎng)偬m，施開創(chuàng)，李 軍，尹彥文

（廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001）

針對J亞群禽白血病病毒（ALV-J）基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異性引物和一條特異性探針，通過構(gòu)建重組陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，建立了檢測ALV-J核酸的熒光定量PCR方法。優(yōu)化反應(yīng)體系和條件后進(jìn)行特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該檢測方法特異性強(qiáng)，與其它禽源病毒如A亞群禽白血病病毒（ALV-A）、B亞群禽白血病病毒（ALV-B）、新城疫病毒（ NDV）、禽流感病毒（AIV）、雞傳染性貧血病毒（CIAV）和馬立克病病毒（MDV）均不發(fā)生交叉反應(yīng)；該方法可檢測到3.2×102拷貝/μL的病毒核酸，與常規(guī)RT-PCR相比，敏感性高100倍；重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于2%。研究結(jié)果表明，建立的Real-time RT-PCR 檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、可重復(fù)性好，可用于ALV-J的定量檢測。

J亞群禽白血病病毒；Taqman 探針；熒光定量PCR

禽白血病（avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（ALV）和禽肉瘤病病毒群病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱[1]。自禽白血病病雞中分離的有6個(gè)亞群，即A、B、C、D、E和J亞群。其中A、B、C、D、J亞群屬于外源性禽白血病病毒，具有致瘤性；E 亞群屬于內(nèi)源性禽白血病病毒，沒有致瘤性[2-5]。J亞群禽白血病由J亞群禽白血病病毒（avian leukosis virus subgroup J，ALV-J）引起的一類禽類傳染性腫瘤疾病。據(jù)推測該亞群病毒為內(nèi)源性ALV與外源性

ALV重組而來[6]。由于誘發(fā)腫瘤、患雞胴體廢棄、產(chǎn)蛋性能下降和其他未知的對雞群生產(chǎn)性能的影響，ALV-J給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重威脅[7]。目前，尚無針對J亞群禽白血病的有效治療方法和疫苗，只能通過特異性診斷并淘汰陽性雞以及采取種群凈化措施來控制該病[8-9]。

目前常用的ALV-J檢測方法有病毒分離與鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)和分子生物學(xué)試驗(yàn)等，這些方法在敏感性、特異性、時(shí)效性等方面均存在不足[10]。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（real-time RT-PCR）是近年來發(fā)展起來的一種新型PCR技術(shù)，既能定性檢測，也能定量檢測，且所需時(shí)間較短、敏感性較高，避免了傳統(tǒng)的RT-PCR后的檢測處理步驟，節(jié)省了時(shí)間和材料[11]，故很快得到了廣泛應(yīng)用。本研究根據(jù)ALV-J基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，旨在建立一種快速、靈敏、特異的ALV-J Real-time RT-PCR檢測方法，為ALV-J的快速診斷和定量檢測提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

J亞群禽白血病病毒（ALV-J）、A亞群禽白血病病毒（ALV-A）、B亞群禽白血病病毒（ALV-B）、新城疫病毒（ NDV）、禽流感病毒（AIV）、雞傳染性貧血病毒（CIAV）和馬立克病病毒（MDV）均由廣西區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存。

1.2 主要試劑和儀器

One Step PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time）、膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒、PMD 18-T Simple Vector均購自Takara公司；DH5α感受態(tài)購自Tiangen；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。熒光定量PCR儀為ABI公司的ABI Step One Plus型。

1.3 引物與TaqMan探針的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 收錄的ALV-J基因序列保守區(qū)域，設(shè)計(jì)1對特異性引物及相應(yīng)的Taqman探針，上游引物：5′-GGAAGACCAAAGGCCATAAA -3′-A，下游引物：5′-CATAGCTTGACCCTGGGAAT-3′，探針序列：JOE- CACACACCACCGGGATTCCGBHQ1。擴(kuò)增片段長度為129bp。將探針的5′端以熒光報(bào)告基團(tuán)JOE標(biāo)記；3′端以熒光淬滅基團(tuán)BHQ1標(biāo)記，引物和探針由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取與cDNA合成

參照RNA提取試劑盒說明書提取雞胚尿囊液中的RNA。

1.5 陽性標(biāo)準(zhǔn)模板的制備

將獲得的RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下：上、下游引物各5 pmol，dNTPs 5 nmol，10×Buffer 2μL，cDNA 2 μL，Taq DNA聚合酶0.5 U，加ddH2O至20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的DNA片段，將目的片段與pMD18-T載體16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定陽性命名為ALV-P，用核酸蛋白分析儀測定陽性質(zhì)粒濃度，并換算成拷貝數(shù)。

1.6 熒光定量RT-PCR方法的建立

1.6.1 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化

參考One Step PrimeScript RT-PCR Kit推薦的反應(yīng)體系和條件，在相同濃度模板和反應(yīng)體系中，采用矩陣法確定引物和探針的最佳濃度。在以上參數(shù)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行熒光定量RT-PCR循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化，整個(gè)優(yōu)化過程綜合考慮Ct值、熒光強(qiáng)度、重復(fù)性等，確定反應(yīng)條件。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，取濃度為3.2×101～3.2×107拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，根據(jù)優(yōu)化后的體系和條件進(jìn)行Real-time RTPCR反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出反應(yīng)的擴(kuò)增效率和曲線的相關(guān)性系數(shù)。

1.6.3 敏感性試驗(yàn)

取濃度為3.2×101～3.2×107拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，根據(jù)優(yōu)化后的體系和條件進(jìn)行Realtime RT-PCR反應(yīng)，同時(shí)以常規(guī)RT-PCR作為參比方法，檢測其靈敏度。

1.6.4 特異性試驗(yàn)

對A亞群禽白血病病毒、B亞群禽白血病病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、雞傳染性貧血病毒和馬立克病病毒分別取等量樣品提取病毒RNA（或DNA），采用所建立的ALV-J Real-time RT-PCR 方法進(jìn)行檢測。

1.6.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取5個(gè)10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，按所建立的Real-time RT-PCR方法分別進(jìn)行批內(nèi)、批間檢測的可重復(fù)性試驗(yàn)。批內(nèi)試驗(yàn)檢測，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)；批間試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立檢測，每次間隔10天，計(jì)算Ct值的平均值和變異系數(shù)（CV）。

1.7 臨床樣品檢測

對廣西區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心收集、保存的221份歷年雞肺、氣管、脾臟等組織進(jìn)行檢測。將提取出的病毒核酸分別進(jìn)行ALV-J實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測和常規(guī)RT-PCR檢測，以評價(jià)其臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒濃度的計(jì)算

測得陽性質(zhì)粒的OD260/OD280=1.74，計(jì)算出質(zhì)粒濃度為0.185μg/μL，其拷貝數(shù)為3.2×108拷貝/μL。

2.2 熒光定量RT-PCR方法的建立

2.2.1 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的建立

經(jīng)反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了最終反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。反應(yīng)體系為20μL：2×One Step RT-PCR Buffer Ш 10μL，Takara Ex Taq HS 0.4μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4μL，Rox Reference Dye Ⅱ（50×）0.4μL，上下游引物、探針各0.8μL，模板RNA 3μL，雙蒸水加至20μL。反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄42℃/5 min；預(yù)變性92℃/10s；92℃/3s，55℃/30s（收集熒光）40個(gè)循環(huán)。

2.2.2 熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過Real-time RT-PCR，得到檢測ALV-J的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。ALV-J Real-time RTPCR 標(biāo)準(zhǔn)品具有良好的線性關(guān)系（ 相關(guān)系數(shù)R2= 0.999，擴(kuò)增效率E = 1.07）。

圖1 熒光定量RT-PCR檢測ALV-J標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅ALV-J出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而ALV-A、ALV-B、NDV、AIV、CIAV、MDV和空白對照均無擴(kuò)增曲線，說明針對ALV-J設(shè)計(jì)的檢測引物和探針特異性好。

2.2.4 熒光定量PCR的敏感性

經(jīng)過檢測，確定Real-time RT-PCR 檢出的最低限為3.2×102拷貝/μL（圖2），常規(guī)PCR 的檢測極限為3.2×104拷貝/μL（圖3）。Real-time RT- PCR與常規(guī)RT-PCR相比，敏感性高100倍。

圖2 real-time RT-PCR 敏感性試驗(yàn)

圖3 常規(guī)RT-PCR的靈敏度檢測

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

取5個(gè)10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品分別做3個(gè)組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示（表1），批內(nèi)試驗(yàn)變異系數(shù)為0.41%～0.79%，批間試驗(yàn)變異系數(shù)為0.51%～0.94%，均小于2%，表明所建立的Realtime PCR方法具有良好的可重復(fù)性。

表1 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的重復(fù)性

2.3 臨床樣品檢測

利用建立的熒光定量RT-PCR方法，對保存的廣西地區(qū)收集的221份病料核酸進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，檢出ALV-J 14份，陽性率為6.33%，檢測結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。

3 討論

目前，禽白血病病毒J亞群對世界養(yǎng)禽業(yè)造成了極大的危害和損失，但仍沒有有效的治療方法，及時(shí)檢測、凈化種群是控制本病的主要手段。目前主要采用病理組織學(xué)、血清學(xué)、PCR等方法檢測和診斷ALV-J。但是病理組織學(xué)法檢測操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；血清學(xué)檢測方法易受外界條件干擾；傳統(tǒng)的PCR無法進(jìn)行定量分析，無法確切檢測出機(jī)體內(nèi)病毒的增殖狀態(tài)。Real-time RT-PCR是將普通PCR通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍?；赥aqMan探針的實(shí)時(shí)熒光PCR不僅具有快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，而且由于該法采用引物和探針的“雙保險(xiǎn)”，因此特異性更強(qiáng)，可避免PCR技術(shù)帶來的假陽性反應(yīng)。

本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測ALV-J的方法，特異性好，只從ALV-J陽性病料中檢測到特異性的擴(kuò)增信號，不與檢測的其他常見家禽傳染病發(fā)生特異性反應(yīng)。試驗(yàn)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率E = 1.07，說明核酸拷貝數(shù)的對數(shù)值與Ct值之間有極顯著的線性關(guān)系，優(yōu)化的體系和條件很好地滿足了試驗(yàn)要求。重復(fù)性試驗(yàn)得出組內(nèi)和組間變異系數(shù)為0.41%～0.94%，說明此方法具有很好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可以穩(wěn)定地用于ALV-J核酸的定量檢測。該試驗(yàn)中建立的曲線可檢測到3.2×102拷貝/μL的初始模板量，檢測敏感性比常規(guī)RT-PCR提高100倍以上。檢測量大，一次可以檢測96份樣品，整個(gè)反應(yīng)都在密閉系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，避免了樣品間的污染。檢測速度快，從樣品處理包括RNA的提取，PCR等到試驗(yàn)結(jié)束，只需4個(gè)小時(shí)，比其他的血清學(xué)檢測方法節(jié)省了時(shí)間，準(zhǔn)確性高。Taq Man探針只與特異性的模板發(fā)生反應(yīng)，假陽性率低，與SYBR Green I相比，不需要考慮引物二聚體和其他非特異性擴(kuò)增。

綜上所述，本研究建立的J亞群禽白血病病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、能夠準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)，為快速檢測病原和定量檢測病毒含量提供了必要的技術(shù)平臺。

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Development and Application of a Real-time RT-PCR Assay for Avian Leukosis Virus Subgroup J

Qu Sujie，Zou Lianbin，Chen Fangfang，Zhang Buxian，Hu Jie，Mo Shenglan，Shi Kaichuang，Li Jun，Yin Yanwen
（Guangxi Center for Animal Disease Control and Prevention，Nanning，Guangxi 53001）

A pair of specific primers and a specific probe was designed according to the ALV-J conserved gene sequence and a plasmid containing the target gene was constructed as a standard control. A real-time PCR assay was developed for detection of ALV-J. After optimization of the reaction conditions，the assay was tested for its specificity，sensitivity and repeatability. Result showed that the assay was highly specific and there were no cross-reactions with other avian pathogens including ALV-A，ALV-B，NDV，AIV，CIAV and MDV. The assay had a detection limit of 3.2×102copies/μL viral RNA，100 times more sensitive than the conventional PCR，and its coefficient of variations was less than 2% in the reproducible test. The results indicated that this real-time RT-PCR assay was of high specificity，sensitivity and reproducibility，and could be used for the quantitative detection of ALV-J.

ALV-J；Taqman probe；Real-time PCR

S8562.65+7

A

1005-944X（2015）06-0056-05

廣西區(qū)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局科技項(xiàng)目（桂漁牧科1204935）

尹彥文