·實(shí)驗(yàn)研究·

芪歸糖痛寧顆粒調(diào)節(jié)炎性因子預(yù)防糖尿病周圍神經(jīng)病變的機(jī)制研究

李道衛(wèi)1，申國(guó)明2， 王浩1， 江愛(ài)娟2，王靚2，尤良震1，王芹1,何瑩1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽 合肥230038；

2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥230038)

[摘要]目的通過(guò)觀察芪歸糖痛寧顆粒預(yù)防性給藥對(duì)相關(guān)炎性因子的影響，探究其改善糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)的機(jī)制。方法將120只SD大鼠分為正常組，模型組，芪歸糖痛寧顆粒高、中、低劑量組和甲鈷胺組，采用鏈脲佐菌素腹腔注射聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)法復(fù)制糖尿病大鼠模型，預(yù)防性給予相應(yīng)藥物8周，以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity，MNCV)和擺尾溫度閾值評(píng)價(jià)DPN的改善情況，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶-1 (matrix metalloproteinase 1,MMP-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(interleukin 1，IL-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)含量。結(jié)果與正常組比較，模型組大鼠擺尾溫度閾值顯著升高(P<0.05)，MNCV顯著下降(P<0.05)，血清MMP-1、TNF-α、IL-1和MCP-1均顯著升高(P<0.05)。芪歸糖痛寧顆粒對(duì)DPN大鼠的MNCV、擺尾溫度閾值及血清MMP-1、TNF-α、IL-1和MCP-1的效應(yīng)具有明顯的劑量依賴性(P<0.05)，不同劑量對(duì)不同指標(biāo)的效應(yīng)呈現(xiàn)不同的量效關(guān)系；不同劑量芪歸糖痛寧顆粒與甲鈷胺對(duì)DPN大鼠的MNCV、擺尾溫度閾值及血清MMP-1、TNF-α和IL-1的效應(yīng)相比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論芪歸糖痛寧顆粒能預(yù)防DPN，其機(jī)制與調(diào)控復(fù)雜的炎性因子網(wǎng)絡(luò)有關(guān)，其效應(yīng)具有明顯的劑量依賴性。

[關(guān)鍵詞]糖尿病周圍神經(jīng)病變；芪歸糖痛寧顆粒；炎性因子；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度；擺尾溫度閾值

[中圖分類號(hào)]R587.2；R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.05.019

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)

作者簡(jiǎn)介：李道衛(wèi)(1987-)，男，碩士研究生

收稿日期：(2015-09-17；編輯：曹健)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，糖尿病病程5、10、20年后DPN發(fā)生率分別達(dá)到30%、60%、90%[1]，主要臨床特征為四肢遠(yuǎn)端(尤其下肢)對(duì)稱性感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)障礙，可出現(xiàn)肢體冷涼、麻木、疼痛、乏力等癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。中醫(yī)藥治療DPN立足于整體觀念和辨證論治，研究[2]表明，DPN的中醫(yī)證型以氣虛血瘀證為主。芪歸糖痛寧顆粒為臨床驗(yàn)方，具有益氣活血、通絡(luò)止痛之功效。既往研究[3-5]表明，益氣活血法治療DPN療效確切。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制DPN大鼠模型，在芪歸糖痛寧顆粒干預(yù)后，觀察坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，同時(shí)檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase 1, MMP-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)含量變化，探討芪歸糖痛寧顆粒改善DPN的作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用該方防治DPN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

通信作者：申國(guó)明，shengm_66@163.com

1　 材料

1.1實(shí)驗(yàn)藥物芪歸糖痛寧顆粒(黃芪30 g，雞血藤15 g，當(dāng)歸、葛根、生地黃各12 g，延胡索、威靈仙各9 g)：由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號(hào) 20140914；甲鈷胺：中國(guó)衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號(hào) 130825A；高脂高糖飼料根據(jù)配方[6]配制，每100 g飼料中含有淀粉17.5 g，大豆粉、蔗糖、雞蛋各10.0 g，麩皮7.0 g，玉米粉12.0 g，魚(yú)粉2.5 g，食鹽、酵母粉各0.5 g，豬油15.0 g，奶粉、麻油、花生各5.0 g，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房加工。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠120只，體質(zhì)量220～280 g，清潔級(jí)。購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-002。

1.3試劑及儀器鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)：購(gòu)于Sigma公司，批號(hào) 20140505422；MMP-1、TNF-α、IL-1、MCP-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒：批號(hào) E-30641，上海源葉生物科技有限公司提供；Powerlab8/30生物信號(hào)采集系統(tǒng)：澳大利亞ADInstruments生產(chǎn)。

2　方法

2.1動(dòng)物分組及模型復(fù)制取上述SD雄性大鼠120只，隨機(jī)選取15只作為正常組，予以普通飼料喂養(yǎng)。其余大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，采用高脂喂飼聯(lián)合STZ的方法[6]復(fù)制糖尿病大鼠模型，即高脂喂飼4周后，大鼠禁食12 h，用pH 4.5的0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液稀釋STZ，按35 mg/kg腹腔注射給藥，72 h后空腹血糖≥16.7 mmol/L者作為STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，低于此值者4 d后第2次按35 mg/kg腹腔注射STZ，測(cè)定血糖以確定模型是否復(fù)制成功，結(jié)果共獲得90只糖尿病模型大鼠。將糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為模型組，甲鈷胺對(duì)照組，芪歸糖痛寧顆粒高、中、低劑量組。

2.2給藥劑量與方法對(duì)芪歸糖痛寧顆粒高、中、低劑量組大鼠分別按每日9.0、4.5、2.25 g/kg劑量(分別相當(dāng)于成人臨床用量的18、9、4.5倍)灌胃給藥，甲鈷銨組大鼠接受甲鈷銨(0.225 mg/kg)灌胃給藥，正常組和模型組大鼠接受同容積蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥8周。實(shí)驗(yàn)期間除正常組外，其他組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。

2.3大鼠擺尾溫度閾值的測(cè)定給藥后8周， 將大鼠寬松地限制在籠內(nèi)，露出其尾部，用恒溫加熱儀(每分鐘加熱2 ℃)加熱水溫，水溫從20 ℃開(kāi)始時(shí)將鼠尾浸入水中約2 cm，鼠尾因水溫增高而擺動(dòng)并露出水面時(shí)記錄水溫，此時(shí)水溫即為擺尾溫度閾值。

2.4坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定用藥8周末，麻醉大鼠，在左坐骨切跡插入電極，在踝部(遠(yuǎn)端)和左足底第二趾間分別插入記錄電極并與Powerlab 8/30生物信號(hào)記錄系統(tǒng)連接，記錄遠(yuǎn)近端坐骨神經(jīng)產(chǎn)生動(dòng)作電位的潛伏期，測(cè)定兩記錄電極間的距離，并計(jì)算運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity，MNCV)。MNCV=記錄電極之間的距離(cm)/動(dòng)作電位潛伏期(s)，比較各組大鼠MNCV的變化。

2.5大鼠血清MMP-1、TNF-α、IL-1、MCP-1含量測(cè)定在給藥第8周腹主動(dòng)脈取血，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定MMP-1、TNF-α、IL-1、MCP-1含量，嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3　結(jié)果

3.1各組大鼠擺尾溫度閾值和MNCV比較①模型因素的影響：與正常組比較，模型組大鼠的擺尾溫度閾值顯著升高(P<0.05)，MNCV顯著下降(P<0.05)。②芪歸糖痛寧顆粒的量效關(guān)系：芪歸糖痛寧顆粒對(duì)DPN大鼠的MNCV和擺尾溫度閾值的效應(yīng)具有明顯的劑量依賴性(MNCV：F=7.30，P=0.001；擺尾溫度閾值：F=262.60，P=0.000)，其中低劑量芪歸糖痛寧顆粒升高DPN大鼠MNCV的效應(yīng)最顯著，高劑量芪歸糖痛寧顆粒降低擺尾溫度閾值的效應(yīng)最顯著。③芪歸糖痛寧顆粒與甲鈷胺的效應(yīng)比較：不同劑量芪歸糖痛寧顆粒和甲鈷胺對(duì)DPN大鼠MNCV和擺尾溫度閾值的效應(yīng)相比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MNCV：F=3.16，P=0.040；擺尾溫度閾值：F=492.53，P=0.000)，其中低、中劑量芪歸糖痛寧顆粒對(duì)DPN大鼠MNCV的效應(yīng)與甲鈷胺相當(dāng)(P>0.05)，低、中、高劑量芪歸糖痛寧顆粒降低DPN大鼠擺尾溫度閾值的效應(yīng)均不及甲鈷胺(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠MNCV和擺尾溫度閾值比較( ± s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與甲鈷胺組比較，△P<0.05。

3.2各組血清MMP-1、TNF-α、IL-1和MCP-1含量比較①模型因素的影響：與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-1、TNF-α、IL-1和MCP-1均顯著升高(P<0.05)。②芪歸糖痛寧顆粒的量效關(guān)系：芪歸糖痛寧顆粒對(duì)DPN大鼠血清MMP-1、TNF-α、IL-1和MCP-1的效應(yīng)均具有明顯的劑量依賴性(MMP-1：F=20.30，P=0.000；TNF-α：F=18.35，P=0.000；IL-1：F=10.08，P=0.000；MCP-1：F=8.93，P=0.000)，其中芪歸糖痛寧顆粒中劑量降低DPN大鼠血清MMP-1和TNF-α的效應(yīng)最優(yōu)，低劑量降低血清IL-1的效應(yīng)最優(yōu)，高劑量降低血清MCP-1的效應(yīng)最優(yōu)。③芪歸糖痛寧顆粒和甲鈷胺的效應(yīng)比較：低、中、高劑量芪歸糖痛寧顆粒對(duì)DPN大鼠血清MMP-1、TNF-α和IL-1的效應(yīng)與甲鈷胺比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MMP-1：F=6.06，P=0.003；TNF-α：F=8.74，P=0.000；IL-1：F=4.21，P=0.014)，其中芪歸糖痛寧顆粒中劑量降低血清MMP-1和TNF-α的效應(yīng)顯著優(yōu)于甲鈷胺(P<0.05)，芪歸糖痛寧顆粒高、低劑量降低血清MMP-1和TNF-α的效應(yīng)與甲鈷胺相當(dāng)(P>0.05)，低劑量降低血清IL-1的效應(yīng)顯著優(yōu)于甲鈷胺組(P<0.05)；不同劑量芪歸糖痛寧顆粒降低血清MCP-1的效應(yīng)與甲鈷胺比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.775，P=0.518)。見(jiàn)表2。

表2　各組血清MMP-1、TNF-α、IL-1和MCP-1含量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與甲鈷胺組比較，△P<0.05。

4　討論

糖尿病是由于體內(nèi)胰島素的絕對(duì)或相對(duì)不足而引起的一系列代謝紊亂。世界衛(wèi)生組織的一項(xiàng)前瞻性研究表明，到2030年將會(huì)有3.53億糖尿病患者[7]。DPN是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。目前，相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，糖尿病及其所并發(fā)的病變(如心血管疾病和神經(jīng)組織病變等)為一系列低等慢性炎癥。DPN的發(fā)生、發(fā)展中存在著大量的炎性細(xì)胞的聚集，導(dǎo)致大量炎性因子(TNF-α、IL-1、MCP-1等)與蛋白酶(如MMP-1)表達(dá)分泌于各相關(guān)組織細(xì)胞外基質(zhì)中，從而導(dǎo)致一系列組織重建事件(如血管化、基質(zhì)彈性蛋白降解、膠原蛋白大量分泌和組成改變等)的發(fā)生。TNF-α是一種主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)IL-1、IL-6、C反應(yīng)蛋白的合成，從而引起DPN。與IL和C反應(yīng)蛋白相比，TNF-α與神經(jīng)病變之間的關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)[8]。在db/db DPN模型小鼠的脊髓背角，TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的水平均有所增加[9]，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠脊髓中，IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)會(huì)增強(qiáng)[10]。綜上，炎性因子在DPN發(fā)病中起到重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用STZ聯(lián)合高脂飼料的方法復(fù)制糖尿病大鼠模型，結(jié)果顯示：與正常組比較，糖尿病模型大鼠MNCV明顯降低，擺尾溫度閾值升高，血清MMP-1、TNF-α、IL-1和MCP-1均顯著升高。結(jié)果表明DPN模型復(fù)制成功，且血清炎性因子可能參與了DPN的發(fā)生發(fā)展。

DPN為西醫(yī)病名，中醫(yī)沒(méi)有相應(yīng)病名，但古代文獻(xiàn)中早有相關(guān)記載[11]。中醫(yī)臨床根據(jù)其主癥診斷為“消渴病·麻木”“消渴病·痿證”“消渴病·痹證”，統(tǒng)稱為“消渴病·痿痹”[12]。其主要病機(jī)是以氣虛、陰虛、陽(yáng)虛失充為本，以瘀血、痰濁阻絡(luò)為標(biāo)，血瘀以其不同的程度而貫穿于DPN整個(gè)病程的始終[13]。因此，在新安醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，遵循益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)的治療原則，創(chuàng)制院內(nèi)制劑芪歸糖痛寧顆粒。方中黃芪大補(bǔ)脾胃元?dú)?，令氣旺血行、瘀去絡(luò)通；當(dāng)歸甘以緩之，故專能補(bǔ)血，辛以散之，故又能行血，補(bǔ)中有動(dòng)，行中有補(bǔ)，化瘀不傷血，與黃芪同用，治本為主，共為君藥；葛根升陽(yáng)、生津止渴；生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津，助黃芪、當(dāng)歸益氣活血生津而為臣藥；雞血藤活血補(bǔ)血，延胡索辛散活血、行氣、止痛，共為佐藥；威靈仙，祛風(fēng)通絡(luò)、止痛，能通行十二經(jīng)脈，有使藥物直達(dá)病所之功，可為使藥之用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)DPN大鼠給予芪歸糖痛寧顆粒高、中、低劑量灌胃給藥，觀察芪歸糖痛寧顆粒的量效關(guān)系。結(jié)果顯示，芪歸糖痛寧顆粒對(duì)DPN大鼠的MNCV和擺尾溫度閾值的效應(yīng)具有明顯的劑量依賴性，對(duì)DPN大鼠血清MMP-1、TNF-α、IL-1和MCP-1的效應(yīng)也均具有明顯的劑量依賴性，不同劑量對(duì)不同指標(biāo)的效應(yīng)呈現(xiàn)不同的量效關(guān)系。另外本實(shí)驗(yàn)還設(shè)置了陽(yáng)性對(duì)照藥甲鈷胺組，觀察芪歸糖痛寧顆粒與陽(yáng)性對(duì)照藥甲鈷胺相比較的意義，結(jié)果也顯示，不同劑量芪歸糖痛寧顆粒與甲鈷胺對(duì)不同指標(biāo)的效應(yīng)也呈現(xiàn)相似或明顯不同的效應(yīng)。結(jié)果表明，芪歸糖痛寧顆粒能夠改善DPN，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控炎性因子發(fā)揮作用，對(duì)其劑量—效應(yīng)關(guān)系的詮釋尚需結(jié)合DPN與炎性因子損傷之間的復(fù)雜關(guān)系。

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Action Mechanism of Qiguitangtongning Granule in Regulating Inflammatory Factors to Prevent Diabetic Peripheral Neuropathy

LIDao-wei1,SHENGuo-ming2,WANGHao1,JIANGAi-juan2,WANGLiang2,YOULiang-zhen1,WANGQin1,HEYing1

(1.ClinicalSchoolofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.GraduateDivision,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

Abstract[]ObjectiveTo investigate the effects of prophylactic administration of Qiguitangtongning Granule on related inflammatory factors and to explore its action mechanism in improving diabetic peripheral neuropathy (DPN). MethodsOne hundred and twenty Sprague-Dawley rats were randomly divided into six groups: normal control group, model group, high-, medium-, and low-dose Qiguitangtongning Granule groups, and methylcobalamin group. A rat model of diabetes was reproduced using intraperitoneally injected streptozotocin combined with high-fat feed. Prophylactic administration of corresponding drugs was performed for 8 weeks. Motor nerve conduction velocity (MNCV) and tail-flick threshold temperature were used to evaluate the improvement in DPN. Enzyme linked immunosorbent assay was applied to determine the serum levels of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin 1 (IL-1), and monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) in rats. ResultsCompared with the normal control group, the model group had significantly increased tail-flick threshold temperature (P<0.05), significantly reduced MNCV (P<0.05), and significantly increased serum levels of MMP-1, TNF-α, IL-1, and MCP-1 (P<0.05). In DPN rats, the effects of Qiguitangtongning Granule on MNCV, tail-flick threshold temperature, and serum MMP-1, TNF-α, IL-1, and MCP-1 were significantly dose-dependent (P<0.05), and the dose-effect relationship varied between different doses and indices; different doses of Qiguitangtongning Granule and methylcobalamin had significantly different effects on MNCV, tail-flick threshold temperature, and serum MMP-1, TNF-α, and IL-1 in DPN rats (P<0.05). ConclusionQiguitangtongning Granule can prevent DPN. Its action mechanism may involve regulating the complicated inflammatory factor network, and its effect has a significant dose dependence.

[Key words]diabetic peripheral neuropathy; Qiguitangtongning Granule; inflammatory factor; motor nerve conduction velocity; tail-flick threshold temperature