梅俊學(xué), 侯旭光, 李信華

(1.山東大學(xué)(威海)海洋學(xué)院, 山東 威海 264209; 2.尋山集團(tuán)有限公司, 山東 威海 264316)

目前的海帶夏苗的室內(nèi)培育是一種集約式的生物培養(yǎng)方式。這種方式在海帶夏苗生產(chǎn)上, 關(guān)鍵是低溫條件。低溫加上較弱的光照, 可以抑制雜藻的繁生,防止某些病害的發(fā)生, 并控制海帶幼體的生長(zhǎng), 以待自然水溫的下降。所以在育苗生產(chǎn)中給予幼苗的低溫并不是其生長(zhǎng)發(fā)育所需要的最適溫。如果生產(chǎn)上能給予幼苗最適培養(yǎng)條件, 從采孢子到孢子體達(dá)到1~2 cm的出庫(kù)標(biāo)準(zhǔn), 大體只要45 d左右時(shí)間。但如果8月上旬采苗后, 在最適條件進(jìn)行培養(yǎng), 那么到9月下旬, 幼苗就能長(zhǎng)到出庫(kù)大小。但是, 這時(shí)正是自然水溫的高溫期。自然水溫要下降到幼苗能出庫(kù)所要求的19℃以下, 在北方海區(qū)最早也要到l0月中旬。幼苗既然不能出庫(kù)下海暫養(yǎng), 室內(nèi)培育條件又滿足不了幼苗生長(zhǎng)的需要, 就可能發(fā)生爛苗。所以在現(xiàn)行的海帶夏苗培育方法中, 不得不用低溫控制幼苗的生長(zhǎng), 減少病害的發(fā)生[1-5]。

為解決以上幾個(gè)問(wèn)題, 20世紀(jì)80年代孫國(guó)玉等試驗(yàn)了“改進(jìn)的海帶夏苗培育法”。當(dāng)幼苗發(fā)育到一定時(shí)期, 將苗簾放在-1~4℃的低溫靜水中, 保存20~70 d。取出后在流水的育苗室內(nèi)培育。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是,在低溫儲(chǔ)藏時(shí)期無(wú)需換水, 因此節(jié)約了用于降溫的電費(fèi)、化肥以及人工。但是由于投資大、操作繁瑣等缺點(diǎn), 這項(xiàng)技術(shù)沒有被生產(chǎn)企業(yè)采用[6-9]。

“海帶配子體克隆育苗技術(shù)”可在一定程度上解決降溫成本問(wèn)題。此項(xiàng)技術(shù)包括大規(guī)模培養(yǎng)配子體、配子體切段、配子體附著、幼苗培育等步驟。這種育苗方法具有品種純度高、育苗時(shí)間短、不受季節(jié)限制、成本低等優(yōu)點(diǎn)。但是仍有一些技術(shù)難點(diǎn), 如克隆大量配子體需要的純凈海水、快速配子體克隆分離、附苗方法、發(fā)育誘導(dǎo)等, 制約了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用[10-12]。

本項(xiàng)目研究的方法通過(guò)完全閉光來(lái)抑制配子體生長(zhǎng)發(fā)育, 能夠有效解決上述問(wèn)題。無(wú)需另建冷庫(kù),利用現(xiàn)有的育苗設(shè)施, 在海帶育苗中的適當(dāng)時(shí)間,將苗簾集中存放, 將育苗水溫從 6.5~8.0℃提高到10.0~10.5℃, 從而達(dá)到節(jié)約能源、節(jié)約人工的目的。

1 材料與方法

本試驗(yàn)的材料是山東威海各海帶育苗場(chǎng)普遍選用的雜交品系, 當(dāng)?shù)厮追Q“笨?！薄８街鶠樯綎|普遍使用的紅棕繩簾和福建普遍使用的維尼綸簾。試驗(yàn)地點(diǎn)在尋山集團(tuán)有限公司所屬青漁灘海帶育苗車間。本車間育苗能力1億株, 共13排串聯(lián)的育苗池,每排3個(gè)池, 每池150~160個(gè)育苗簾。在其他試驗(yàn)中,為了將試驗(yàn)池水溫調(diào)節(jié)至高于其他池, 將室內(nèi)靠東面的一排池的供水渠截開, 成為專用供水池。池內(nèi)水流部分來(lái)自經(jīng)過(guò)沉淀、過(guò)濾、制冷和添加營(yíng)養(yǎng)鹽后的海水, 水溫6.5~8.0 ℃, 與其他普通育苗池所用海水相同, 另一部分海水是直接從海區(qū)抽取的自然海水, 水溫 22~27℃, 使試驗(yàn)用供水池的水溫調(diào)節(jié)至(10±1)℃。

由于海帶的配子體微小, 雌配子體只有一個(gè)細(xì)胞, 直徑11~22 μm, 雄配子只有6~8個(gè)細(xì)胞組成, 而且聚集在一起, 很難準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。所以用它們產(chǎn)生的幼孢子體, 即海帶苗的數(shù)量代表配子體的成活率。每次試驗(yàn)結(jié)束時(shí), 從育苗簾上隨機(jī)剪取 1 cm苗繩 9段,計(jì)數(shù)大于 0.2 cm的健康苗, 數(shù)據(jù)用 SPSS進(jìn)行ANOVA分析。

1.1 靜水黑暗條件下維尼綸和紅棕繩簾上儲(chǔ)存配子體

2009年 8月 13日隨常規(guī)生產(chǎn)采孢子, 密度為160倍顯微鏡視野中 15~20個(gè)游動(dòng)孢子, 在 8℃、800~2 000 lx光照強(qiáng)度下培育配子體。至第12天時(shí),取紅棕繩和維尼綸簾各12張, 折疊后分別放入6個(gè)體積50 L的塑料桶中, 每桶4張簾子, 桶內(nèi)注滿6.5℃育苗用海水, 加蓋, 然后將塑料桶置于(6±0.5) ℃儲(chǔ)水池中。在這樣的黑暗靜水條件下儲(chǔ)存14 d后, 在傍晚將簾子移回常規(guī)海帶育苗池內(nèi)?；謴?fù)光照后的前3天維持800~1 500 lx的弱光照, 隨后的光照強(qiáng)度隨育苗庫(kù)內(nèi)其他苗簾一起調(diào)節(jié), 一般為 1500~4000 lx,育苗池內(nèi)的流動(dòng)海水溫度在6.5~8℃。直至10月12日測(cè)量和記錄孢子體苗平均長(zhǎng)度和密度。同一育苗庫(kù)內(nèi)的其他苗簾作為對(duì)照組, 它們均沒有經(jīng)過(guò)黑暗處理, 始終在流水的育苗室內(nèi)。在試驗(yàn)組黑暗處理期間, 對(duì)照組水溫6.5~8.0℃, 光照強(qiáng)度800~2 000 lx。試驗(yàn)總共持續(xù)60 d。

1.2 流水黑暗條件下紅棕繩簾上儲(chǔ)存不同發(fā)育時(shí)期的配子體

試驗(yàn)組紅棕繩簾150張, 分別在3個(gè)育苗池中,每池50張。2010年8月11日, 隨常規(guī)生產(chǎn)采孢子, 密度為 160倍顯微鏡視野中 15~20個(gè)游動(dòng)孢子, 在(10±0.5)℃、500~2 000 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)。培育至第6天、第8天和第10天時(shí), 分別將一個(gè)池內(nèi)的50張簾子垛疊 3~4層, 然后用兩層黑色塑料布將育苗池覆蓋, 使附著在苗簾上的配子體處于黑暗、流水環(huán)境中, 水溫(10±0.5)℃。14 d后, 在傍晚移除黑塑料布, 將堆放的苗簾分散放回原來(lái)的水池中, 使黑暗處理過(guò)的配子體次日開始接受光照, 光照強(qiáng)度在初始的3天內(nèi)從500~750 lx提高到1500~2000 lx, 隨后的光照強(qiáng)度隨苗庫(kù)內(nèi)其他苗簾一起調(diào)節(jié), 一般為1 500~4 000 lx, 育苗池內(nèi)的流動(dòng)海水溫度在10~11℃。直至10月12日測(cè)量和記錄孢子體苗平均長(zhǎng)度和密度。對(duì)照組培育條件同1.1。

1.3 紅棕繩簾上配子體在流水黑暗條件下儲(chǔ)存不同時(shí)間

黑暗處理開始時(shí)間為采孢子后第 8天, 黑暗處理時(shí)間為12、14和16 d, 其他條件與1.2相同。

1.4 流水黑暗條件下儲(chǔ)存配子體用于規(guī)模育苗生產(chǎn)

2013年 8月 13日做中試規(guī)模試驗(yàn), 紅棕繩簾2000張, 采孢子后第 8天時(shí)開始黑暗處理, 處理時(shí)間12 d, 其余操作同1.2。至10月12日試驗(yàn)結(jié)束。

2 結(jié)果

2.1 靜水條件下維尼綸和紅棕繩網(wǎng)簾黑暗儲(chǔ)存配子體

黑暗儲(chǔ)存結(jié)束時(shí)在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn), 維尼綸簾配子體色素褪去, 但是細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍完整; 紅棕繩簾上的部分配子體失去色素, 結(jié)構(gòu)完整; 部分配子體解體死亡?；謴?fù)光照后第4天, 配子體的色素重新出現(xiàn)?；謴?fù)光照8 d時(shí), 幼孢子體出現(xiàn)在苗簾上。試驗(yàn)結(jié)束后時(shí), 兩種育苗器上的海帶苗(≥0.2 cm)平均密度分別為49株/cm和19株/cm, 而對(duì)照組為54株/cm,方差分析表明, 三者的差異顯著(表1)。

表1 紅棕繩和維尼綸育苗簾黑暗靜水中存儲(chǔ)配子體后出苗數(shù)以及方差分析Tab.1 Sporeling density (sporelings/cm rope) of gametophytes treated in dark on palm and synthetic panels and results of one-way ANOVA

2.2 流水黑暗條件下紅棕繩簾上儲(chǔ)存不同發(fā)育時(shí)期的配子體

黑暗處理開始時(shí)配子體分別為6 d、8 d和10 d,它們分別代表未成熟(即仍處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段)、部分成熟(部分處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段, 部分開始生殖階段,偶爾見幼孢子體)和成熟(大部分配子體進(jìn)入生殖階段, 幼孢子體在每個(gè)顯微鏡視野中均可見到)的配子體。盡管在黑暗處理后配子體失去色素, 但是僅有少量配子體死亡?；謴?fù)光照第8天時(shí), 在3個(gè)試驗(yàn)組的苗簾上都出現(xiàn)幼孢子體。試驗(yàn)結(jié)束后時(shí), 3組處理的苗簾上幼苗(≥0.2 cm)的平均密度分別為 59株/cm,64株/cm 和 58株/cm, 而對(duì)照組為61株/cm。方差分析表明, 3個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組的差異不顯著(表2)。3組均達(dá)到國(guó)家GB/T 15807-1995三類苗簾標(biāo)準(zhǔn)。

表2 不同發(fā)育時(shí)期的配子體在黑暗處理后出苗數(shù)以及方差分析Tab.2 Sporeling density (sporelings/cm rope) of gametophytes treated in dark for 14 days at different developmental stages and results of one-way ANOVA

2.3 紅棕繩簾上配子體在流水黑暗條件下儲(chǔ)存不同時(shí)間

試驗(yàn)結(jié)束后時(shí), 3組處理的苗簾上幼苗(≥0.2 cm)的平均密度分別是66株/cm, 64株/cm, 47株/cm, 而對(duì)照組為61株/cm。方差分析表明, 3個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組的差異顯著(表3)。黑暗處理時(shí)間16 d的一組大于0.2 cm的苗少, 只有47株/cm, 但是小于0.2 cm的幼苗高達(dá)51株/cm。黑暗處理12 d和14 d的苗簾達(dá)到國(guó)家GB/T 15807-1995三類苗簾標(biāo)準(zhǔn)。

表3 黑暗處理配子體不同時(shí)間后出苗數(shù)以及方差分析Tab.3 Sporeling density (sporelings/cm rope) of gametophytes treated in dark for 12, 14 and 16 days at 8th day of development and results of one-way ANOVA

2.4 流水黑暗條件下儲(chǔ)存配子體用于規(guī)模育苗生產(chǎn)

幼苗(≥0.2 cm)平均 82 株/cm, 幼苗(≥1.5 cm)平均18株/cm, 所有苗簾均達(dá)到國(guó)家GB/T 15807-1995二類苗簾標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

從表1可以看出, 即使在靜水中, 海帶配子體也具有忍受黑暗的能力, 本項(xiàng)結(jié)果與海帶屬其他種的研究結(jié)果相似[13]。但是與維尼綸簾相比, 紅棕繩簾上配子體的存活率較低, 可能是紅棕繩中的滲出物對(duì)海帶配子體產(chǎn)生了傷害。在試驗(yàn)2的流水條件下, 滲出物被水流帶走, 因此配子體得以存活。

表2、表3和規(guī)范育苗生產(chǎn)結(jié)果表明, 在流水條件下, 12 d和 14 d的黑暗處理、育苗水溫提高到(10±0.5)℃, 對(duì)配子體的存活、發(fā)育以及形成孢子體的能力并沒有顯著的不利影響。這樣的配子體能夠培育出合格的海帶夏苗。黑暗處理16 d時(shí), 因?yàn)樵诠庹障屡嘤龝r(shí)間過(guò)短, 導(dǎo)致孢子體沒有足夠時(shí)間發(fā)育至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的長(zhǎng)度。

根據(jù)上述研究結(jié)果, 可以將現(xiàn)行的海帶育苗過(guò)程做如下改進(jìn): (1)按常規(guī)方法采孢子; (2)整個(gè)育苗過(guò)程的水溫從目前的6.5~8℃提高到(10±0.5) ℃; (3)在采孢子8 d后, 將苗簾集中存放, 3~4層為一疊, 加蓋黑色塑料布遮光; (4)黑暗處理12~14 d后, 在傍晚移除覆蓋物。恢復(fù)光照后的頭 3天緩慢提高光照, 從500~750 lx提高到1 500~2 000 lx; (5)其他管理措施同傳統(tǒng)育苗方法。

改進(jìn)后的技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn): (1)育苗水溫從6.5~8℃提高到 10℃, 因此節(jié)約制冷費(fèi)用; (2)黑暗儲(chǔ)存配子體時(shí), 苗簾3~4層垛疊擺放, 因此可以節(jié)約2/3到3/4的用水量; (3)儲(chǔ)存期間無(wú)需人工管理, 因此節(jié)約人工; (4)沒有復(fù)雜的操作和技術(shù), 容易掌握; (5)不需要另加投資。該技術(shù)的創(chuàng)新點(diǎn): (1)模仿海帶在自然界的生活環(huán)境, 是本技術(shù)依據(jù)的理論基礎(chǔ)。自然海水中海帶放散孢子在春季和秋季, 水溫為 10~20℃, 孢子的萌發(fā)和配子體的形成和發(fā)育也在這個(gè)溫度范圍內(nèi)。但是由于配子體生長(zhǎng)緩慢, 而且是在水平面上生長(zhǎng),容易被生長(zhǎng)較快且直立生長(zhǎng)的海藻如水云、滸苔等覆蓋, 不能得到足夠的光照而停止發(fā)育, 也可以說(shuō)進(jìn)入休眠狀態(tài)。等到晚秋, 當(dāng)覆蓋的雜藻死亡并流失后, 海帶配子體才有機(jī)會(huì)得到光照, 恢復(fù)生長(zhǎng)和發(fā)育。在被覆蓋期間, 配子體所處的條件是流水、黑暗。這是本技術(shù)的理論核心。(2)與孫國(guó)玉等的“改進(jìn)的海帶夏苗培育法”相比。此方法的理論基礎(chǔ)是, 生活在極地海洋里的海帶類的藻體, 由于低溫(-1.6~4℃),它們的代謝作用進(jìn)行的極端緩慢, 在漫長(zhǎng)昏暗的極夜期間存活著, 待極晝到來(lái)時(shí)又繼續(xù)旺盛地生長(zhǎng)繁殖。因此, 這種方法建議, 將配子體移入0~-2℃的靜止海水中置冷庫(kù)存儲(chǔ) 20~120d或 8℃儲(chǔ)存 20~30d。在海帶苗出庫(kù)下海前約50d, 由冷庫(kù)移入育苗庫(kù)中按常規(guī)育苗法培育成合乎標(biāo)準(zhǔn)的幼苗。本方法的重點(diǎn)是低溫、靜水和無(wú)光。但存在的問(wèn)題是: ①處理后的配子體仍移回育苗庫(kù)按常規(guī)的育苗法培育, 即 6.5~8.5℃培育約40~50 d, 仍需要昂貴的降溫費(fèi)用。②對(duì)苗簾的潔凈度要求較高。因?yàn)樵陟o水中儲(chǔ)存, 積累有害物質(zhì)是不可避免的, 因此在采集孢子前, 需要對(duì)紅棕繩苗簾進(jìn)行額外的處理。③需要將苗簾在育苗庫(kù)和冷庫(kù)間搬運(yùn), 增加了人工。④低溫、靜水不符合海帶在自然條件下的生活狀態(tài)。在海上, 海帶自然放散孢子并形成的配子體的季節(jié)是春季和秋季, 自然水溫是15℃左右, 而且是流水條件。因此低溫靜水條件下配子體存活率較低。⑤另外建冷庫(kù), 額外投資較大, 而且冷庫(kù)利用率低, 每年只有兩個(gè)月時(shí)間有用[6-9]。(3)與海帶配子體克隆育苗技術(shù)相比。此方法的理論基礎(chǔ)是, 分離后單獨(dú)培養(yǎng)的雌、雄配子體都能形成無(wú)性繁殖系(克隆), 即絲狀體。將大量單獨(dú)培養(yǎng)的雌雄絲狀體切碎后混合培養(yǎng), 仍然會(huì)分別產(chǎn)生雌雄配子, 并受精后形成孢子體, 也就是海帶幼苗。這項(xiàng)技術(shù)存在的問(wèn)題是: ①培養(yǎng)條件導(dǎo)致配子體畸形發(fā)育。在正常條件下雌配子體是單細(xì)胞, 而雄配子體是由少數(shù)細(xì)胞組成的簡(jiǎn)單絲狀體。在人工的雌雄配子體分離培養(yǎng)條件下, 都長(zhǎng)成復(fù)雜的分枝體和簇狀體, 甚至發(fā)生孤雌生殖或孤雄生殖, 并可能染色體加倍。這樣很難得到大量正常健康的配子體和孢子體幼苗。②畸形的配子體導(dǎo)致附苗不牢固, 不均勻。③目前的配子體克隆分離、發(fā)育誘導(dǎo)技術(shù)都還不成熟, 需要進(jìn)一步完善[10-12]。

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