張麗紅 , 劉艷芳 胡青平

(1.山西師范大學(xué) 生命學(xué)院, 山西 臨汾 041004; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100083)

生物固氮是氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié), 為整個(gè)生物圈提供了重要的氮素營(yíng)養(yǎng)源。生物固氮反應(yīng)是一種極其溫和及零污染排放的生化反應(yīng), 它與人類發(fā)明的化學(xué)固氮相比有著無(wú)比優(yōu)越性, 固氮微生物的深入研究、開(kāi)發(fā)和利用, 有利于發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè), 達(dá)到土地可持續(xù)利用的戰(zhàn)略目標(biāo)[1]。在生物固氮中, 大約40%的氮源由海洋固氮生物完成, 60%的氮源由陸生固氮生物完成。人們已對(duì)多個(gè)海域(阿拉伯海、紅海、太平洋、中國(guó)南海、大西洋)進(jìn)行了固氮微生物多樣性的分析[2-4], 結(jié)果顯示海洋中固氮微生物多集中于海洋沉積物中。目前文獻(xiàn)報(bào)道的海洋固氮微生物包括三大類: 異養(yǎng)細(xì)菌類、光合細(xì)菌類以及藍(lán)藻類[5-7]。2012年, Farnelid等[8]對(duì)海洋固氮微生物群落固氮酶基因庫(kù)信息全面分析后提出: 海洋中占固氮微生物總數(shù) 42%的微生物群落屬于非藍(lán)藻細(xì)菌。這一結(jié)果表明在海洋生態(tài)系統(tǒng)中非藍(lán)藻細(xì)菌發(fā)揮著不可低估的固氮作用。海洋中已報(bào)道的異養(yǎng)固氮細(xì)菌包括克氏桿菌屬(Klebsiella)、固氮菌屬(Azotobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、產(chǎn)氣腸桿菌屬(Enterobacter)、弧菌屬(Vibrio)等屬中的一些種[9]。

南海是僅次于阿拉伯海和珊瑚海的世界第三大陸緣海, 是海洋資源非常豐富的地區(qū)之一。迄今, 有關(guān)分離培養(yǎng)南海固氮菌的報(bào)道并不多見(jiàn)[10], 本研究采集南海底泥樣品并采用煮沸淤泥樣品結(jié)合無(wú)氮培養(yǎng)基富集培養(yǎng)的方法進(jìn)行初篩, 進(jìn)一步通過(guò)固氮酶分子標(biāo)記及固氮酶活性檢測(cè)進(jìn)行復(fù)篩, 最終獲得一株固氮菌。對(duì)所獲菌株形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)及16S rDNA序列等結(jié)果進(jìn)行分析確定其分類地位。這一研究為海洋自生固氮菌的多樣性提供了新的證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 固氮類芽孢桿菌的分離

1.1.1 海底淤泥樣品的采集及處理

底 泥 樣 品 采 自 南 海 東 經(jīng) 110°51′227′′, 北 緯20°42′193′′; 水深 29 m 處(pH 8.30); 采集的樣品封口于測(cè)序袋后并立即置于冰盒內(nèi)(定期更換冰盒), 帶回實(shí)驗(yàn)室后, 儲(chǔ)存在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

無(wú)氮培養(yǎng)基: 用于分離、純化固氮菌。2% (w/v)蔗糖; 1.2% (w/v) 磷酸氫二鉀; 0.34% (w/v) 磷酸二氫鉀; 0.05%(w/v) 硫酸鎂; 0.001% (w/v) 氯化鈉; 0.0015%(w/v) 氯化鐵; 0.0005%(w/v) 鉬酸鈉; 1.2%~1.4%(w/v) 瓊脂粉; pH 7.0。

限氮培養(yǎng)基: 用于測(cè)定固氮酶活性。1000 mL ddH2O 中溶解 26.3 g Na2HPO4?12H2O; 3.4 g KH2PO4;10 μg 生物素; 26 mg CaCl2?2H2O; 30 mg MgSO4;0.33 mg MnSO4?H2O; 36 mg 檸 檬 酸 鐵 ; 7.6 mgNa2MoO4?2H2O; 10 μg 對(duì)氨基苯甲酸; 4 g 葡萄糖; 谷氨酸終濃度為2 mmol/L。

1.1.3 分離方法

稱取適量淤泥樣品以1/10比例加入液體無(wú)氮培養(yǎng)基中, 30℃富集培養(yǎng)1 h。系列梯度稀釋后于沸水中煮沸 10 min, 以期獲得能產(chǎn)芽孢的菌株(期間搖動(dòng)3~5次), 每個(gè)稀釋度各取 100μL涂布于無(wú)氮平板中,于30℃培養(yǎng)3 d。挑取單菌落多次劃線純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌株的鑒定

將菌株接種到LB培養(yǎng)基, 30℃培養(yǎng)過(guò)夜, 利用光學(xué)顯微鏡觀察革蘭氏染色結(jié)果; 利用電子顯微觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)特征; 各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[11]和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[12]進(jìn)行。

1.3 nifH基因的擴(kuò)增

采用菌落 PCR方法, 以固氮菌Paenibacillus sophoraeS27T(DSM23020T)為陽(yáng)性對(duì)照(菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳三鳳教授提供), 檢測(cè)固氮酶保守基因nifH。引物(PolF/PolR)參照參考文獻(xiàn)[13]。具體序列如下: PolF 5′-3′TGCGAYCCSAARGCBGACTC; PolR 5′-3′ATSGCCATCATYTCRCCGGA, 擴(kuò)增產(chǎn)物約 360 bp。擴(kuò)增體系 20 μL, 組成如下: 10×PCR緩沖液 2 μL,dNTP 混合物(10 mmol/L)0.5 μL, 引物各 0.5 μL, Tap酶1~2 U, 菌落少許, 無(wú)菌水16.5μL。充分混勻。擴(kuò)增程序: 95℃ 10 min; 95℃ 30 s; 55℃ 30 s; 72℃ 30 s。30個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物。將符合測(cè)序要求的PCR產(chǎn)物送北京博邁德公司測(cè)序, 序列相似性分析使用軟件 DNAMAN完成; 基因比對(duì)通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST在線完成。

1.4 菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增

引物: 采用 通 用引物 對(duì) 27F (5′-3′TACGGCTACCTTGTTACGACTT)以及 1492R(5′-3′AGA-GTT TGATCCTGGCTCAG)進(jìn)行擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物約1.5 kb。擴(kuò)增體系為50μL, 反應(yīng)條件如下: 95℃ 5 min, 94℃1 min, 50℃ 1 min, 72℃ 2 min, 30 個(gè)循環(huán), 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物凝膠系統(tǒng)檢測(cè)后送北京博邁德公司測(cè)序。序列相似性分析及基因比對(duì)方法同上。

1.5 固氮酶活性的檢測(cè)

根據(jù) Aranibar等[14]測(cè)定固氮菌酶活性的方法,將活化菌株接種到液體培養(yǎng)基LB中, 于30℃搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜, 用無(wú)菌去離子水清洗3遍后, 限氮培養(yǎng)基調(diào)整OD600=0.3左右, 分別取1 mL菌液加入滅菌的26 mL的厭氧管中, 反復(fù)抽充N(xiāo)2后, 用注射器注入?yún)捬豕苁Ｓ囿w積的10%的乙炔, 30℃振蕩培養(yǎng), 每隔2 h, 從厭氧管中取100 μL氣體, 采用氣相色譜儀測(cè)定固氮酶活性(負(fù)對(duì)照為未接種的管, 固氮菌P.sophoraeS27T菌株為正對(duì)照)。固氮酶活[nmol/(mg·h)]的計(jì)算公式為:

1.6 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

nifH與 16S rDNA基因序到 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),BLASTN在線比對(duì)同源序列, 從 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載與提交序列相似性較高的基因序列。使用DNAMAN、MEGA5軟件中ClustalX功能比對(duì)序列,鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), bootstrap值設(shè)為1000。

2 結(jié)果

2.1 類芽孢固氮菌的分離和篩選

2.1.1 固氮菌的分離

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)、從南海底泥中分離到30株能在無(wú)氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株, 進(jìn)一步分離純化后, 保存?zhèn)溆?。?duì)30株菌株進(jìn)行固氮菌保守基因nifH的擴(kuò)增, 進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)篩。被測(cè)試菌株菌落邊緣整齊, 圓形扁平, 呈乳白色, 表面比較光滑、濕潤(rùn)。

2.1.2 固氮酶基因nifH的擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

nifH是固氮微生物的“分子標(biāo)記”。目前, 固氮微生物分子水平的檢驗(yàn)主要集中在nifH。用nifH兼并引物對(duì)挑選得到的30株菌進(jìn)行了PCR擴(kuò)增, 結(jié)果只從7株菌株中擴(kuò)增到目的基因nifH, 7株菌株編號(hào)分別為: NH-1、NH-3、NH-9、NH-15、NH-21、NH-24及NH-30(圖1)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收測(cè)序, 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。通過(guò)DNAMAN軟件分析, 7株菌株之間nifH同源性達(dá)到 99%以上, 因此, 后續(xù)試驗(yàn)選擇其中一株NH-1作為代表菌株。根據(jù)其DNA序列推測(cè)的氨基酸序列, GenBank在線比對(duì)分析表明,NH-1的nifH與其他已知固氮菌的nifH具有較高的同源性(同源性 70%以上)。從 NCBI數(shù)據(jù) GenBank中下載相關(guān)菌株的nifH序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 結(jié)果如圖2所示。以上結(jié)果表明, 該菌基因組中確實(shí)存在固氮保守基因nifH。nifH基因序列已上傳至 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(GenBank登錄號(hào)KJ627375)。

2.1.3 固氮酶活性測(cè)定

根據(jù) Aranibar等[14]測(cè)定固氮菌酶活性的方法,對(duì)該菌株固氮酶活性進(jìn)行了測(cè)定, 結(jié)果如下: 陽(yáng)性菌株 S27T的固氮酶活為 283.3±33.1[nmol C2H4/(mg蛋白/h)], 該菌株固氮酶活為 897.4±11.8 [nmol C2H4/ (mg蛋白/h)], 最終確定該菌株具有固氮能力。

圖1 nifH PCR擴(kuò)增圖Fig.1 Amplification of the nifH gene of the isolates

2.2 菌株NH-1的表型特征

菌株NH-1為桿狀, 大小(0.5~0.7) μm×(1.5~2.5) μm,革蘭氏染色為陽(yáng)性, 能運(yùn)動(dòng), 端生鞭毛(圖3), 產(chǎn)芽孢(圖4)。其生理生化特性見(jiàn)表1所示。

2.3 菌株NH-1 16S rDNA序列PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株NH-1 16S rDNA序列的測(cè)定結(jié)果已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(GenBank登錄號(hào)KJ627376)。將序列導(dǎo)入 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù), 利用 BLAST在線比對(duì), 結(jié)果顯示菌株 NH-1與固氮類芽孢桿菌屬模式菌株P(guān)aenibacillus stellifer的 16S rDNA 同源關(guān)系最近(達(dá)到99%)。從GenBank中選出與NH-1同源性較高的10株菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖5)。結(jié)果顯示, NH-1在進(jìn)化樹(shù)中與Paenibacillus stellifer的親緣關(guān)系最近。根據(jù)固氮菌NH-1的形態(tài)特征、生理生化特性、固氮酶活性及16S rDNA序列分析, 將篩選到的產(chǎn)芽孢固氮菌定名為Paenibacillussp.NH-1。

圖2 NH-1 nifH系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of nifH gene of NH-1 and other diazotrophic bacteria

圖3 NH-1菌株鞭毛透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopic image showing the flagellum of strain NH-1

圖4 菌株NH-1芽孢掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microphotograph of the isolate NH-1

表1 固氮類芽孢桿菌Paenibacillus sp.NH-1生理生化特征Tab.1 Morphological and biochemical characteristics of the isolate NH-1

3 討論及結(jié)論

盡管人類已從多種環(huán)境中分離得到了固氮菌,但是到目前為止, 仍然有許多的固氮菌在實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)法成功培養(yǎng)。所有固氮生物的鐵蛋白均由nifH基因編碼, 因此, 研究人員往往通過(guò)對(duì)nifH的分析來(lái)了解環(huán)境中固氮微生物的生物多樣性及進(jìn)化地位。目前, 海洋環(huán)境中異養(yǎng)固氮細(xì)菌的多樣性研究大多集中在固氮酶保守基因nifH水平的檢測(cè)上。1993年, 在對(duì)芽孢桿菌屬51個(gè)種的16S rDNA序列比對(duì)后, 類芽孢桿菌(Paenibacillus)被單獨(dú)分離出來(lái)形成一個(gè)新屬[15]。該屬細(xì)菌是一類 GC含量較低、能產(chǎn)芽孢, 兼性厭氧生長(zhǎng)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。到2013年統(tǒng)計(jì)為止, 該屬已經(jīng)包括100多個(gè)種和兩個(gè)亞種, 其中19個(gè)種被確定為固氮菌[15-18]。固氮類芽孢菌純培養(yǎng)物的報(bào)道多見(jiàn)于陸地土壤, 海洋中的報(bào)道并不多見(jiàn)。Steward等[19]利用固氮酶基因nifH檢測(cè)技術(shù)對(duì)加利福尼亞高鹽度莫諾湖水進(jìn)行固氮菌多樣性的分析研究, 結(jié)果顯示該環(huán)境中存在有固氮類芽孢桿菌;Choi等[20]從韓國(guó)東海海底淤泥中分離到一株能夠降解木聚糖的菌株P(guān)aenibacillus donghaensissp.Nov.,在DNA水平檢測(cè)到固氮酶基因nifH后, 初步確定該菌株具有固氮作用。此外, Dang等[21]利用固氮酶基因nifH擴(kuò)增技術(shù)對(duì)中國(guó)南海北部固氮細(xì)菌進(jìn)行研究,結(jié)果表明該海洋同樣分布有固氮類芽孢桿菌。由于這些固氮類芽孢菌的確認(rèn)都是基于基因水平, 并未檢測(cè)到它們的具體固氮酶活性, 因此, 無(wú)法比較這些菌株與本實(shí)驗(yàn)中分離得到的純培養(yǎng)物 NH-1之間固氮酶活性的差異。本實(shí)驗(yàn)利用純培養(yǎng)技術(shù)分離得到 NH-1, 通過(guò)固氮酶活性檢測(cè)、形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定、系統(tǒng)發(fā)育分析等, 最終確定該菌株為固氮類芽孢菌。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Dang等[21]研究結(jié)果保持一致, 進(jìn)一步豐富了海洋中固氮菌的多樣性。

隨著海洋固氮生物多樣性的深入研究, 人們發(fā)現(xiàn)海洋自生固氮菌的多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人類之前的認(rèn)識(shí)。固氮菌的開(kāi)發(fā)和研究對(duì)充分發(fā)揮生物固氮在農(nóng)業(yè)中的作用具有十分重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值[22-24]。自生固氮微生物因其獨(dú)立生活條件下就能實(shí)現(xiàn)固氮而成為研究生物菌肥的熱點(diǎn)。固氮類芽孢菌在微生物菌劑方面有著巨大的開(kāi)發(fā)潛能和利用價(jià)值。目前已知的固氮類芽孢桿菌種類較少, 因此不同環(huán)境中固氮類芽孢桿菌的篩選, 對(duì)科學(xué)研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著十分重要的意義。

圖5 NH-1 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of NH-1 and those of other bacteria

致謝:感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李穎教授為本實(shí)驗(yàn)提供的南海海底淤泥樣品; 感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳三鳳教授對(duì)本實(shí)驗(yàn)酶活性測(cè)定提供的幫助。

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