羅園珍　李軍華　(武漢鐵路職業(yè)技術學院，湖北　武漢　430205)

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華法林對心力衰竭模型大鼠心功能及心肌Na+-K+-ATPase亞基表達的影響

羅園珍李軍華(武漢鐵路職業(yè)技術學院，湖北武漢430205)

〔摘要〕目的探討華法林對心力衰竭模型大鼠心功能及對心肌Na+-K+-ATPase亞基表達的影響。方法選取Wistar大鼠88只，按隨機數(shù)字表達法隨機分為正常組、模型組、地高辛組(32 μg/kg)、華法林組(0. 25 mg)，每組22只。除了正常對照大鼠外，其他三組大鼠行心力衰竭模型手術，正常組行假手術造模，于造模第3周起予以各組大鼠相應的藥物進行灌胃治療，1次/d，連續(xù)灌胃4 w。末次灌胃后采用彩色多普勒超聲診斷儀測定各組大鼠的心功能指標左心室射血分數(shù)(LVEF)及左心室舒張末內徑(LVEDD);采用酶聯(lián)免疫方法檢測各組大鼠動脈血清的腦鈉肽(BNP)含量;采用Western印跡和RT-PCR檢測各組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATPase α1和α2亞基蛋白及mRNA相對表達量。結果①與正常組相比，模型組大鼠LVEF明顯降低，而LVEDD、BNP明顯升高(P＜0. 01);與模型組相比，地高辛組和華法林組大鼠LVEF明顯升高，而LVEDD、BNP明顯降低(P＜0. 05);②與正常組相比，模型組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATPase α1和α2亞基蛋白及mRNA相對表達量明顯降低(P＜0. 01);③與模型組相比，地高辛組和華法林組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATPase α1和α2亞基蛋白及mRNA相對表達量明顯升高(P＜0. 05)。結論心力衰竭大鼠心肌組織中Na+-K+-ATPase亞基處于低表達水平，華法林能夠通過升高Na+-K+-ATPase亞基表達，改善心衰大鼠心功能，降低腦鈉肽含量，對臨床具有指導意義，值得臨床推廣。

〔關鍵詞〕華法林;心力衰竭;心功能; Na+-K+-ATPase

心力衰竭是各種心血管疾病的最終結果，表現(xiàn)為呼吸困難和無力而導致體力活動受限和水腫〔1〕。本病多發(fā)于中老年人群，并有逐年上升趨勢〔2〕。導致本病原因以原發(fā)性心肌損害和心臟負荷過重為主?，F(xiàn)代醫(yī)學多采取去除誘因，強心、利尿、擴血管為主要治療大法。目前臨床中采用血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)作為治療心衰的一線用藥，但長期使用會造成不同程度的咳嗽、心悸和頭暈，降低患者的生活質量。研究發(fā)現(xiàn)〔3〕，華法林具有抑制凝血因子的活性，抑制血栓的形成，能夠有效清除已形成的血栓，提高心力衰竭患者預后。本文通過觀察心衰模型大鼠左心室射血分數(shù)(LVEF)、左心室舒張末內徑(LVEDD)、腦鈉肽(BNP)、Na+-K+-ATPase亞基表達水平變化，來探究華法林對心衰的影響及作用機制。

1　資料與方法

1. 1動物6周齡Wistar雄性大鼠88只，平均體重(153± 14)g，大鼠購于中國科學院上海動物中心(合格證號: D20021024)。

1. 2藥品、試劑及儀器華法林鈉(生產單位:上海信誼藥廠有限公司，批準文號:國藥準字H31022123，2010-06-09);地高辛(上海信誼藥廠有限公司，批準文號:國藥準字H31020678，2009-11-24); BNP試劑購于賽馳生物公司; Trizol試劑購于美國GIBCO公司;大鼠ATP α1、α2核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒、超純RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒均購于美國Promega公司; Philips-IE33彩色多普勒超聲診斷儀，購于美國PHILIPS公司，頻率為3～8 mHz小兒心臟探頭。

1. 3心衰大鼠模型建立將88只Wistar雄性大鼠按隨機數(shù)字表達法隨機分為正常組、模型組、地高辛組(32 μg/kg)、華法林組(0. 25 mg/d)，每組22只。除正常對照組，其他三組大鼠行心力衰竭模型手術，腹腔注入10%水合氯醛麻醉后，備皮消毒，無菌操作下于胸骨左側切開皮膚，逐層分離肌肉，剪開心包，暴露心臟，于左心耳下緣進針深約1. 5 mm，從右上方肺動脈圓錐方向出針，穩(wěn)定約1 min后，將結扎線收緊，結扎，逐層縫合，結束造模手術。正常組大鼠行開關手術，腹腔注射麻醉后，備皮，消毒，無菌操作下切開皮膚，逐層分離肌肉，剪開心包，暴露心臟，然后逐層縫合，結束手術。四組大鼠手術后均置于相同環(huán)境下飼養(yǎng)2 w，采用Philips-IE33彩色多普勒超聲診斷儀檢測心動圖，若射血分數(shù)＜50%，說明心衰造模成功。造模成功后，正常組和模型組予以10 mg/kg生理鹽水灌胃;地高辛組予以32 μg/kg地高辛灌胃;華法林組給予0. 25 mg華法林鈉灌胃;各組大鼠灌藥治療4 w，每天灌藥1次。

1. 4觀察指標及檢測方法

1. 4. 1各組大鼠心功能測定四組大鼠予以相應藥物灌胃治療4 w后，用10%的水合氯醛將大鼠進行麻醉，胸口備皮，采用Philips-IE33彩色多普勒超聲診斷儀測量計算LVEF及LVEDD，取2個心動周期，算其平均值。

1. 4. 2各組大鼠血液中BNP水平測定麻醉理想后，消毒，無菌操作下打開胸腔，剪開心包，暴露心臟及主動脈，抽取主動脈血5 ml，加入含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝劑的真空管中混勻，采血后，游離心臟，取出心臟浸泡于10%中性甲醛溶液中，固定24 h。動脈血3 000 r/min離心10 min，抽取血清，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定血清中BNP含量。

1. 4. 3 Western印跡法檢測四組大鼠Na+-K+-ATPase亞基表達

無菌操作下，分別取四組大鼠心臟組織50 mg，將選取好的組織經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，將洗滌后的組織研磨、離心收集，用冰冷PBS洗滌細胞3次后，加入裂解緩沖液，搖勻，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min離心10 min，吸取上清液，即胞質蛋白。采用二奎啉甲酸(BCA)法對樣品蛋白質進行蛋白定量。調整樣品蛋白量為30～40 μg后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，并將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PBS洗膜5 min后，PBS溶解封閉PVDF膜2 h。繼而加入兔抗人ATP α1抗體、兔抗人ATP α2抗體(按1∶1 000稀釋)或抗β-actin(1∶2 000稀釋)，置于4℃環(huán)境中過夜。PBS洗滌3次，10 min/次，加入二抗，溫室孵育2 h。再次用PBS洗滌3次，10 min/次。將PVDF膜增強化學發(fā)光法(ECL)顯色，在暗室中將PBVF曝光于X光片中，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結果。

1. 4. 4 RT-PCR法檢測四組大鼠心臟組織中Na+-K+-ATPase亞基基因表達水平總RNA的提取:把取出的心臟組織剪碎、研磨，置于0. 2%膠原酶中消化，采用D-Hank液清洗，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min離心8 min，制備成單細胞沉淀，向單細胞沉淀中加入1 ml Trizol試劑，采用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。實驗操作按產品說明書進行，用紫外分光光度法測定RNA的A260/A280確定總RNA純度。反轉錄聚合酶鏈反應:根據(jù)逆轉錄試劑盒要求進行反轉錄反應操作，按照相關文獻資料設計聚合酶鏈反應(PCR)中內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、ATP α1和ATP α2引物，將RNA模板、引物、5xRT Buffer和RNase-free水溶解并置于冰上備用，將2 μl Primer mix試劑和10 μl消化后RNA分別加入20 μl反應體系的第一部分，混勻。PCR反應體系為: SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μl，PCR正義引物(10 μmol/L)0. 4 μl，PCR反義引物(10 μmol/L)0. 4 μl，ROX Reference DyeⅡ0. 4 μl，cDNA模板2 μl，dH2O 6. 8 μl，總反應體系為20 μl。經過PCR反應條件的優(yōu)化，PCR循環(huán)條件為94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共35個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。引物序列見表1。

表1　目的基因的實時定量RT-PCR引物序列

結果分析: PCR產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳后，溴乙啶染色，通過成像分析scion軟件計算和比較ATPα1和ATPα2產物條帶的吸光度值，并與GAPDH條帶光密度值比較，計算出ATPα1和ATPα2在大鼠心肌組織中mRNA表達含量相對值。1. 5統(tǒng)計學方法應用SPSS17. 0軟件進行t檢驗。

2　結果

2. 1四組大鼠心功能指標比較與正常組比較，模型組大鼠LVEF明顯降低(P＜0. 01)，LVEDD及BNP水平明顯升高(P＜0. 01);與模型組比較，地高辛組和華法林組大鼠LVEF明顯升高(P＜0. 05)，LVEDD及BNP水平明顯降低(P＜0. 05)。正常組、地高辛組和華法林組三組大鼠心功能指標相比無明顯差異(P＞0. 05)。見表2。

表2　四組大鼠心功能指標比較(x±s，n=22)

2. 2四組大鼠Na+-K+-ATPase蛋白表達的比較與正常組(0. 76±0. 18，0. 64±0. 04)相比，模型組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATPase α1和α2蛋白表達水平(0. 19±0. 04，0. 04±0. 02)明顯降低(P＜0. 01);與模型組相比，地高辛組(0. 54±0. 13，0. 37± 0. 06)和華法林組(0. 56±0. 12; 0. 35±0. 07)明顯升高(P＜0. 05)。正常組、地高辛組和華法林組三組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATPase α1和α2蛋白表達水平相比無明顯差異(P＞0. 05)。見圖1。

2. 3四組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATPase亞基mRNA表達的比較如圖2所示，與正常組(0. 67±0. 09，0. 54±0. 05)相比，模型組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATPase α1和α2亞基mRNA表達水平(0. 13±0. 07，0. 11±0. 04)明顯降低(P＜0. 01);與模型組相比，地高辛組(0. 44±0. 11，0. 41±0. 07)和華法林組(0. 46± 0. 10，0. 38±0. 05)明顯升高(P＜0. 05)。正常組、地高辛組和華法林組三組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATPase α1和α2亞基mRNA表達水平相比無明顯差異(P＞0. 05)。

圖1　四組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATPase α1、α2亞基蛋白表達結果

圖2　四組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATPase α1、α2亞基mRNA表達結果

3　討論

慢性心力衰竭預后差，死亡率高，是嚴重威脅人類生命健康的主要心血管疾病之一〔4〕。本病以原發(fā)性心肌損害及心臟負荷過重為基本病因，以呼吸道感染、心律失常為主要誘因〔5〕。隨著人民生活水平的提高，高脂、高糖及不規(guī)律飲食是慢性心力衰竭患者處于逐年增長的狀態(tài)?，F(xiàn)代醫(yī)學中，采用強心、利尿、擴血管為主要治療原則，ACEI和ARB為目前臨床中一線抗心衰治療藥物，雖能起到良好的臨床療效，但是長期服用會導致較嚴重的副作用，嚴重影響患者生活質量〔6〕。研究表明〔7〕，Na+-K+-ATP酶在維護心功能中起著重要的作用，當心功能不全時，Na+-K+-ATP酶含量也隨之改變。

本研究結果說明Na+-K+-ATPase α1和α2亞基表達與心功能水平呈正相關，心功能越好，Na+-K+-ATPase α1和α2亞基表達越高;華法林和地高辛能夠明顯提高Na+-K+-ATPase α1和α2亞基表達，從而改善心衰大鼠的心功能。Na+-K+-ATP酶又稱鈉泵，是一種既具有離子轉運、強心甙類配體結合的作用，又有轉運酶至血管壁的重要結構蛋白，鈉泵能夠維持細胞膜內外Na+、K+濃度差，維持正常的細胞興奮，同時還可以阻止大量的Na+進入細胞膜內，破壞正常的細胞結構和功能，其活動所產生的能量能夠為其他生理活動所利用，因此鈉泵不僅僅參與心衰的產生，還決定心衰的預后和轉歸〔8〕。鈉泵受損時，使細胞膜內外Na+、K+平衡遭到破壞，使大量Na+進入細胞內，大量K+流出細胞外，而細胞內大量的Na+與Ca2+交換，使細胞內Ca2+的聚集，從而損傷心肌細胞，若血栓堵塞冠狀動脈，造成心肌缺血缺氧，從而產生心力衰竭〔9〕。本實驗為上述論斷提供了證據(jù)。華法林為維生素K拮抗劑，具有抑制抗凝蛋白C和S的羥基化，抑制維生素K依賴凝血因子的合成，有效降低了血液凝固〔10〕。研究表明〔11〕，華法林沒有溶栓作用，能夠通過抑制血栓的形成，清除已形成的血栓，恢復冠狀動脈的正常血流量，改善心肌的缺血缺氧狀態(tài)，恢復正常的心室排出量和心臟功能。華法林對心衰具有治療作用，能夠改善泵血功能，心肌收縮能力，同時升高心力衰竭大鼠Na+-K+-ATPase α1和α2亞基的表達水平。因此推測，華法林可能是通過調節(jié)Na+-K+-ATPase α1和α2亞基的表達來實現(xiàn)心衰大鼠心肌功能的改善〔12〕。

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〔2015-01-22修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5747-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 028

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R541

第一作者:羅園珍(1963-)，女，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事內科臨床研究。