侯劍峰，袁昕，張浩，鄭哲，胡盛壽

基礎(chǔ)與實驗研究

低能激光照射對梗死后心肌微環(huán)境影響的實驗研究*

侯劍峰，袁昕，張浩，鄭哲，胡盛壽

目的：探討低能激光照射（LLLI）對梗死后心肌微環(huán)境的影響。

方法：冠狀動脈結(jié)扎法制作SD大鼠心肌梗死模型。3周后，經(jīng)超聲心動圖篩選合格心肌梗死大鼠隨機分為三組：①LLLI 組：心肌梗死后開胸接受LLLI預處理（n=26）；②對照組：心肌梗死后單純開胸，日光燈照射（n=27）;③假手術(shù)組：單純開胸，冠狀動脈左前降支只穿線不行結(jié)扎（n=24）。LLLI 預處理采用635 nm 半導體低能激光（輸出功率：5 mW；照射時間：150秒；能量密度：0.96 J/cm2）開胸單次照射。LLLI 預處理后1小時、1天、1 周，以免疫蛋白印跡法和實時定量聚合酶鏈反應法分別檢測預LLLI 處理區(qū)內(nèi)心肌組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的表達，分別以黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測定LLLI 預處理區(qū)內(nèi)心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，TUNEL法檢測照射區(qū)心肌細胞凋亡，超聲心動圖評價左心功能。

結(jié)果：LLLI顯著提高了梗死后心肌組織中VEGF、GRP78的表達及SOD的活性，降低了MDA的含量。但未能顯著改善梗死周邊區(qū)心肌細胞凋亡和左心功能。

結(jié)論：LLLI能夠通過降低梗死后心肌組織氧化應激水平改善局部微環(huán)境。

低能激光照射；心肌梗死；微環(huán)境

Methods: The myocardial infarction (MⅠ) model was established by left anterior descending (LAD) artery ligation in female rats. 3 weeks later, the qualified MⅠ rats were randomly divided for 3 groups:①LLLⅠpreconditioning group, the rats received thoracotomy for LLLⅠ by a 635nm, 5mW diode laser with the energy density of 0.96 J/cm2for 150 seconds, n=26. ②Control group, the rats received thoracotomy for daylight irradiation, n=27.③Sham operation group, the rats received thoracotomy without LAD ligation, n=24. The Expressions of myocardial vascular endothelial growth factor (VEGF), glucose-regulated protein 78 (GRP78), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) were evaluate by real time-PCR, Western blot analysis and other relevant laboratory test at 1 hour, 1 day and 1 week after treatment. The myocardial cell apoptosis was examined by TUNEL staining, and left ventricular function was detected by echocardiography.

Results: LLLⅠ preconditioning obviously increased the myocardial VEGF, GRP78 expression and SOD activity, decreased MDA production; while it could not really improve the myocardial cell apoptosis at periinfarcted area and left ventricular function in experimental rats.

Conclusion: LLLⅠ preconditioning may improve the milieu of infarcted myocardium via decreasing the oxidative stress in experimental rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:47.)

低能激光照射（LLLI）療法是使用輸出功率為毫瓦級的低能量或低強度激光處理靶組織，在不引起組織或細胞損傷的情況下，對組織局部或全身起到刺激、調(diào)節(jié)、活化等生物刺激效應的激光療法[1]。本研究旨在利用LLLI生物刺激效應作為預處理策略，觀察LLLI對梗死后心肌組織微環(huán)境的作用并初步分析其作用機制。

1 材料與方法

實驗動物與方法：2011-09至2013-10期間進行研究，實驗動物為SPF級SD大鼠，均由北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，6～8周齡，體重260～280 g，雌雄各半。采用冠狀動脈結(jié)扎法建立心肌梗死模型[2]。3周后，使用超聲心動圖篩選大鼠心肌梗死模型[左心室短軸縮短率（LVFS）＜30%，左心室射血分數(shù)（LVEF）＜60%]，將77只存活大鼠隨機分為三組：①LLLI 組（n=26）：心肌梗死后開胸接受LLLI預處理；②對照組（n=27）：心肌梗死后單純開胸，日光燈照射；③假手術(shù)組（n=24）：單純開胸，冠狀動脈左前降支只穿線不行結(jié)扎。

低能激光照射療法預處理方法：InGaAsP半導體低能激光治療儀，調(diào)節(jié)激光輸出模式為連續(xù)輸出模式，激光輸出波長635 nm，600 μm光導纖維傳輸，光纖末端輸出功率5 mW，照射距離26 mm，光斑直徑10 mm，功率密度6.37 mW/cm2。根據(jù)實驗需要調(diào)定照射時間為150 s，相對應的能量密度為0.96 J/cm2。自制直徑為10 mm無菌碘伏紗布在激光照射時遮蓋除照射區(qū)之外其他組織，避免激光散射引起實驗誤差。

觀察指標：LLLI 預處理后1小時、1天、1周，以免疫蛋白印跡法（Western blotting）和實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法分別檢測LLLI預處理區(qū)內(nèi)心肌組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的表達，分別以黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測定LLLI預處理區(qū)內(nèi)心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法（TUNEL法）檢測照射區(qū)心肌細胞凋亡，超聲心動圖評價左心功能。

統(tǒng)計學分析：應用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示；組間差異性比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠梗死后心肌組織中血管內(nèi)皮生長因子、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78表達及超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量的比較

LLLI預處理對照射區(qū)域梗死后心肌組織中VEGF、GRP78的表達、SOD的酶活及MDA的含量的不同時間點監(jiān)測結(jié)果如圖1所示。在預處理后1小時和1天，與對照組比較，LLLI組梗死后心肌組織中VEGF、GRP78的表達及SOD活性均顯著提高（P＜0.05）；而MDA含量顯著降低（P＜0.05）。在預處理后1周，LLLI組與對照組的上述指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 低能激光照射預處理對梗死后心肌組織的影響

2.2 低能激光照射預處理對心肌梗死邊帶區(qū)細胞凋亡的影響

LLLI預處理后1周，組織冰凍切片經(jīng)熒光顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)：發(fā)生凋亡的細胞經(jīng)TUNEL法檢測，陽性結(jié)果為細胞核呈黃綠色，典型圖片如圖2所示。對照組和LLLI組的凋亡細胞百分比分別為（10.3±1.9）%和（10.1±1.8）%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 低能激光照射對心肌梗死邊帶區(qū)細胞凋亡的影響

2.3 左心室功能評價

為了評價LLLI對心功能的改善情況，LLLI后1周對各個實驗組進行超聲心動圖檢測。LLLI組與對照組比較，左心室射血分數(shù)[（43.26±5.02）% vs（41.86±3.46）%]、左心室短軸縮短率[（17.27±2.44）% vs（16.56±1.67）%]、左心室舒張末期內(nèi)徑[（6.17±0.52） mm vs（6.24±0.50）mm]和左心室收縮末期內(nèi)徑[（7.45±0.52） mm vs（7.49±0.61）mm]，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

LLLI是經(jīng)FDA審批的無顯著危害級（NSR）物理治療設(shè)備，由于其安全性高，成本低及操作簡便，LLLI物理治療已被臨床廣泛接受。既往研究顯示，能量密度為1～4 J/cm2的LLLI治療在多種疾病的治療中顯示出良好的治療效果[3,4]。在本研究中LLLI的參數(shù)設(shè)定如下：輸出功率為5 mW，照射時間為150 s，功率密度為6.37 mW/cm2，能量密度為0.96 J/cm2。通過LLLI預處理梗死后心肌組織，我們主要對LLLI進行了兩方面指標的評價：以GRP78，VEGF為代表評價LLLI提高照射區(qū)細胞保護因子分泌；以SOD、MDA的測定評價LLLI提高局部組織抗氧化能力作用。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LLLI在細胞移植前的預處理顯著提高了照射局部組織VEGF和GRP78的表達。而VEGF和GRP78在局部心肌組織內(nèi)的提高已被證實可以在心肌缺血過程中發(fā)揮重要的心肌保護作用[5-7]。在Tuby等[8]的研究顯示，LLLI單次直接照射心肌組織，可以顯著提高急性心肌梗死后心肌組織內(nèi)VEGF和iNOS的表達，從而發(fā)揮心肌保護作用，限制了心肌梗死面積的擴大。

我們的研究也發(fā)現(xiàn)：LLLI在細胞移植前的預處理顯著提高梗死后組織中抗氧化物質(zhì)SOD的酶活，抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。在Zhu等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，以660 nm波長的LLLI處理冷保存的大鼠離體心臟，能夠促進復蘇后心臟功能的恢復，這一作用認為與LLLI處理使心肌細胞內(nèi)ATP的含量及抗氧化酶的活性得以維持有關(guān)。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，LLLI單次預處理心肌組織產(chǎn)生顯著微環(huán)境改善效應在預處理后迅速出現(xiàn)，但在1周即消失，而且這種短暫的心肌微環(huán)境改善作用對梗死周邊區(qū)心肌細胞的凋亡以及心功能的改善沒有顯著影響，這一結(jié)果提示我們，選擇新的組織穿透力較好的LLLI設(shè)備或是改進LLLI預處理的技術(shù)，如設(shè)計以光導纖維進行激光傳輸經(jīng)皮穿刺行LLLI心肌表面預處理的技術(shù)可能進一步提高預處理效果。

[1] Moshkovska T, Mayberry J. It is time to test low level laser therapy in Great Britain. Postgrad Med J, 2005, 81: 436-441.

[2] 張浩,胡盛壽,鄭哲, 等.高齡和青年大鼠骨髓間質(zhì)細胞移植對缺血心臟心功能的影響.中華心血管病雜志, 2004, 32: 359-361.

[3] Manchini MT, Serra AJ, Feliciano Rdos S, et al. Amelioration of cardiac function and activation of anti-inflammatory vasoactive peptides expression in the rat myocardium by low level laser therapy. PLoS One, 2014, 9: e101270.

[4] 郭靜萱, 陳明哲. 心血管病激光治療的現(xiàn)狀與展望. 中國循環(huán)雜志, 1993, 12: 754-756.

[5] Rehman J, Traktuev D, Li J, et al. Secretion of angiogenic and antiapoptoticfactors by human adipose stromal cells. Circulation, 2004, 109: 1292-1298.

[6] Shintani-Ishida K, Nakajima M, Uemura K, et al. Ischemic preconditioningprotects cardiomyocytes against ischemic injury by inducing GRP78. BiochemBiophys Res Commun, 2006, 345: 1600-1605.

[7] 劉燃, 孫林, 張戈. 人參皂苷Rg1對缺血再灌注損傷的保護機制研究進展. 中國循環(huán)雜志, 2014, 1: 77-79.

[8] Tuby H, Maltz L, Oron U. Modulations of VEGF and iNOS in the rat heart by low level laser therapy are associated with cardioprotection and enhanced angiogenesis. Lasers Surg Med, 2006, 38: 682-688.

[9] Zhu Q, Yu W, Yang X, et al. Photo-irradiationimproved functional preservation of the isolated rat heart. Lasers Surg Med, 1997, 20: 332-339.

Effect of Low-Level Laser Irradiation Preconditioning on Milieu of Infarcted Myocardium in Experimental Rats

HOU Jian-feng, YUAN Xin, ZHANG Hao, ZHENG Zhe, HU Sheng-shou.
Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Ⅰnstitute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China Corresponding Author: HU Sheng-shou, Email: shengshouhu@yahoo.com

Objective: To explore the effect of low-level laser irradiation (LLLⅠ) preconditioning on milieu of infarcted myocardium in experimental rats.

Low-level laser irradiation; Myocardial infarction; Milieu

2014-08-04）

（編輯：許 菁）

北京市科技新星計劃（Z111107054511080）；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)計劃（2013D009008000004）

100037北京市，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 國家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國家重點實驗室作者簡介：侯劍峰 主治醫(yī)師 博士 主要從事冠心病外科基礎(chǔ)與臨床研究 Email: hjf2006111@163.com 通訊作者：胡盛壽

Email: shengshouhu@yahoo.com

R54

A

1000-3614（2015）01-0047-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.01.013