鄭曦，楊永健，孫梅芹，馬雙陶，張立平，王強(qiáng)，葉挺巧

間歇性低溫刺激減少載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膠原含量的研究

鄭曦，楊永健，孫梅芹，馬雙陶，張立平，王強(qiáng)，葉挺巧

目的：研究間歇性低溫刺激對載脂蛋白E（ApoE-/-）基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膠原含量的影響。

方法：20只8周齡的雄性ApoE-/-小鼠被隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組小鼠每天8：00至12：00置于（4±1）°C環(huán)境中，其余時(shí)間和對照組小鼠一樣處于（24±2）°C環(huán)境。飼養(yǎng)12周后，Masson染色了解小鼠主動脈根部動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膠原情況，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測小鼠主動脈基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）2、9及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1的表達(dá)情況。

結(jié)果：Masson染色見實(shí)驗(yàn)組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)膠原含量低于對照組，Western blot實(shí)驗(yàn)組小鼠主動脈MMP2、MMP9表達(dá)高于對照組，TIMP1表達(dá)低于對照組。

結(jié)論：間歇性低溫刺激可能通過破壞MMPs/TIMPs之間的平衡，引起動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膠原含量減少，造成易損斑塊的形成，導(dǎo)致急性冠狀動脈綜合征的發(fā)生。

間歇性低溫；動脈粥樣硬化；基質(zhì)金屬蛋白酶；膠原；易損斑塊

Methods: A total of 20 male ApoE-/-mice at 8 weeks of age were divided into 2 groups: Experimental group, the mice had intermittent cold exposure at (4 ± 1)°C from 8am to 12noon and Control group, the mice were living at (24 ± 2) °C. All animals were treated for 12 weeks, n=10 in each group. The collagen content of atherosclerotic plaque at the aortic root in ApoE-/-mice was observed by Masson staining, the protein expressions of aortic MMP-2, MMP-9 and TⅠMP-1 were examined by Western blot analysis.

Results: Compared with Control group, the Experimental group presented the lower collagen content of atherosclerotic plaque at the aortic root, higher protein expressions of MMP-2, MMP-9 and lower protein expression of TⅠMⅠ 1.

Conclusion: Ⅰntermittent cold stress may disturb the balance of MMP/TⅠMP and decrease collagen content of atherosclerotic plaque to form vulnerable plaque in experimental ApoE-/-mice which may cause acute coronary syndrome.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:68.)

急性冠狀動脈綜合征（ACS）是目前造成人類死亡的重要原因。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示在寒冷的冬天，冠心病的死亡率會增加[1,2]。最近的一項(xiàng)研究顯示，在中國，嚴(yán)重的低溫天氣會增加缺血性心臟病的死亡風(fēng)險(xiǎn)[3]。雖然已經(jīng)觀察到低溫與冠心病猝死之間的聯(lián)系，但是其引起冠心病急性發(fā)作的確切機(jī)制尚不明確。動脈粥樣硬化斑塊的破裂通常會導(dǎo)致冠心病急性事件的發(fā)生。有破裂傾向的冠狀動脈粥樣硬化斑塊被稱作為易損斑塊，其主要特征是斑塊的壞死中心表面覆蓋著一層薄的纖維帽。易損斑塊的纖維帽含有較少的膠原纖維[4]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）削弱纖維帽從而導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）可以負(fù)向調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶活性，兩者協(xié)同控制膠原纖維的表達(dá)[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討間歇性低溫刺激對斑塊穩(wěn)定性的影響。

1 材料和方法

實(shí)驗(yàn)動物及試劑：2013-08至2013-12選擇20只遺傳背景為C57BL/6J的8周齡雄性載脂蛋白E（ApoE-/-）小鼠，體重21～24g，購于北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司。兔抗小鼠MMP2、MMP9、TIMP1抗體購自武漢博士德公司，Masson三色染色液購于南京建成生物有限公司，甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒購于北京北化康泰試劑有限公司，全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物科技研究所。

實(shí)驗(yàn)動物的分組、干預(yù)及取材：20只遺傳背景為C57BL/6J的8周齡雄性ApoE-/-小鼠被隨機(jī)分為對照組及實(shí)驗(yàn)組，每組10只。對照組小鼠全天飼養(yǎng)于環(huán)境溫度為（24 ± 2）℃的清潔級動物房中。實(shí)驗(yàn)組小鼠同樣飼養(yǎng)于溫控清潔級動物房中，每日有4小時(shí)（8:00 am to 12:00 am）處于（4 ± 1）℃中，其余時(shí)間處于（24 ± 2）℃的環(huán)境中。12周的低溫干預(yù)后開始取材。取小鼠的血漿、心臟（包含主動脈根部組織）及胸腹主動脈。

體重、血糖、血脂的測定：12周后用電子秤給每只小鼠稱體重，使用羅氏血糖檢測儀檢測小鼠的血糖，從小鼠頸靜脈處收集血液標(biāo)本，3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取血漿，按血脂試劑盒使用說明進(jìn)行操作[6]。

Masson染色檢測小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)膠原含量：4%的多聚甲醛固定小鼠心臟（包含主動脈根部），脫水，包埋，切片（一邊切一邊鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)主動脈根部出現(xiàn)完整的瓣膜后開始連續(xù)切片），常規(guī)脫蠟、水化、脫水，使用快速M(fèi)asson染液染色試劑盒，按試劑盒說明書操作，封片，鏡下觀察,圖中藍(lán)色區(qū)域表示膠原纖維，并使用IPP軟件對圖像進(jìn)行分析。

蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測小鼠主動脈MMP2、MMP9、TIMP1的表達(dá)：取小鼠胸腹主動脈，進(jìn)行全蛋白提取，然后是蛋白濃度測定[7]，配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入兔抗小鼠MMP2、MMP9、TIMP1抗體，洗滌，加II抗，洗滌，顯像。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用 Graph Pad Prism 4統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0. 05認(rèn)為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 間歇性低溫刺激對兩組ApoE-/-小鼠體重、血糖、血脂的影響

12周的低溫干預(yù)后兩組間小鼠體重, 血糖,TG,TC,LDL-C,HDL-C差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表1

表1 間歇性低溫刺激對兩組ApoE-/-小鼠體重、血糖、血脂的影響（±Se）

2.2 間歇性低溫刺激對兩組ApoE-/-小鼠斑塊內(nèi)膠原含量的影響

12周的低溫干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組小鼠主動脈根部動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膠原含量低于對照組 （圖1A,1B,1C），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.28，P＜0.01）。

2.3 間歇性低溫刺激對兩組ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)MMP2、MMP9、TIMP1的影響

12周的低溫干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組小鼠主動脈

MMP2、MMP9的表達(dá)量大于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.99，P＜0.01和t=3.02，P＜0.05），TIMP1的表達(dá)量小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.69，P＜0.05）。圖2A，2B

圖1 間歇性低溫對兩組ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膠原含量的影響

圖2 間歇性低溫刺激對兩組ApoE-/-小鼠主動脈MMP2、MMP9及TIMP1的影響

3 討論

低溫天氣會增加急性冠狀動脈綜合征的發(fā)病率及死亡率，但其具體機(jī)制尚不是十分明確。目前的研究顯示，間歇性低溫刺激會引起ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膠原含量的減少，造成主動脈內(nèi)MMP2、MMP9的表達(dá)上升和TIMP1的表達(dá)下降。

大量的研究證明，易損斑塊的形成是導(dǎo)致急性冠狀動脈綜合征的重要原因。斑塊內(nèi)纖維帽的厚度決定動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。纖維帽是斑塊內(nèi)脂質(zhì)成分與血液的屏障，其主要作用是維持斑塊的結(jié)構(gòu)完整從而起到抵抗血流沖擊，防止斑塊的破裂及繼發(fā)血栓形成。而膠原是動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)纖維帽的主要成分之一。膠原纖維的含量影響纖維帽的厚度。我們的研究表明，在經(jīng)過12周的低溫刺激后，實(shí)驗(yàn)組小鼠斑塊內(nèi)膠原含量低于對照組。

糖脂代謝異常是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的重要因素。已經(jīng)有研究證實(shí)，體內(nèi)代謝的紊亂，比如肥胖、高血糖、高血脂會促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的生長并導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定。Kozyreva等[8]的研究報(bào)告顯示，對于高血壓或者血壓正常的大鼠，冷應(yīng)激會引起大鼠體內(nèi)血漿LDL的明顯下降和HDL的明顯上升。然而最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[9]，將ApoE-/-小鼠和LDL受體缺陷小鼠置于4℃環(huán)境中，8周后，其血漿TC和HDL-C較對照組明顯升高。出現(xiàn)這樣的結(jié)果，或許與實(shí)驗(yàn)所采取的溫度、實(shí)驗(yàn)持續(xù)的時(shí)間、冷卻速度以及實(shí)驗(yàn)動物的基因背景不同有關(guān)系。目前的實(shí)驗(yàn)顯示，在12周的低溫干預(yù)后，兩組間小鼠的體重、血糖、血脂沒有明顯的差異。目前的研究顯示間歇性低溫刺激導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定與小鼠體內(nèi)的糖脂代謝無關(guān)。

MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)，通過對動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膠原纖維的降解，削弱纖維帽，造成斑塊的不穩(wěn)定，而TIMPs表達(dá)增加能夠抑制MMPs活性，阻止斑塊破裂，增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性[10]。目前認(rèn)為MMPs是低溫導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)因子。在易損斑塊中，炎性細(xì)胞分泌MMPs增多，破壞斑塊的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致急性冠狀動脈事件的發(fā)生。我們的實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，低溫導(dǎo)致動脈粥樣

硬化斑塊失穩(wěn)的同時(shí)，主動脈中MMP2、MMP9的表達(dá)上升，而TIMP1的表達(dá)量下降。研究結(jié)果表明，MMPs與TIMPs之間的失衡是間歇性低溫刺激導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定性的重要因素。因此，在臨床工作中，恢復(fù)MMPs與TIMPs之間的平衡是預(yù)防低溫促進(jìn)斑塊破裂的一個(gè)有效方法。

總之，目前的實(shí)驗(yàn)表明，間歇性低溫刺激通過造成MMP2、MMP9與TIMP1之間的失衡，減少斑塊內(nèi)膠原含量，導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定。目前的研究結(jié)果對闡明低溫刺激造成急性冠狀動脈綜合征的發(fā)病率及死亡率增加的機(jī)制提供新思路。

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Intermittent Cold Stress Reducing the Collagen Content of Atherosclerotic Plaque in Experimental ApoE-/-Mice

ZHENG Xi, YANG Yong-jian, SUN Mei-qin, MA Shuang-tao, ZHANG Li-ping, WANG Qiang, YE Ting-qiao.
Department of Cardiology, General Hospital of PLA Chengdu Military Area Command, Chengdu (610083) Sichuan, China
Co-corresponding Authors: YANG Yong-jian, Email: yongjiany@yahoo.cn and SUN Mei-qin, Email: meiqinsun@163.com

Objective: To investigate the influence of intermittent cold stress on collagen content of atherosclerotic plaque in experimental ApoE-/-mice.

Ⅰntermittent cold stress; Atherosclerosis; Matrix metalloproteinase (MMP); Collagen; Vulnerable plaque

2014-04-27）

（編輯：汪碧蓉）

610083 四川省成都市，中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科

鄭曦 住院醫(yī)師 碩士 研究方向：動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)與臨床 Email：zheng71466667@126.com 通訊作者：楊永健 Email：yongjiany@yahoo.cn孫梅芹 Email：meiqinsun@163.com

R54

A

1000-3614( 2015 )01-0068-04

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2015.01.018