黃強輝，洪葵，程曉曙，胡建新

冷刺激對乳鼠心肌細胞縫隙連接蛋白43的影響及藥物干預的研究

黃強輝，洪葵，程曉曙，胡建新

目的： 在急性冷刺激乳鼠心肌細胞模型下，評價縫隙連接蛋白43（Connexin43,Cx43）的表達及研究急性冷刺激時乳鼠心肌細胞間傳導的變化及其機制。

方法: 乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)，隨機分為正常對照組，實驗4℃組；實驗0℃組；并在實驗4℃組和實驗0℃組分別加入100 nmol/L 抗心律失常肽（APP）10，每組乳鼠8只。采用流式細胞術（FCM）分析各組細胞的凋亡率，應用聚合酶鏈反應(PCR)和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測Cx43及其磷酸化水平在基因和蛋白上的表達。

結果: FCM結果顯示：實驗4℃組和實驗0℃組隨著冷刺激程度加強和低溫時間的延長，心肌細胞的凋亡率增加；同時PCR結果顯示：實驗4℃組和實驗0℃組Cx43 mRNA呈現不同程度的下降；Western blot結果顯示：實驗4℃組和實驗0℃組隨著刺激強度和低溫時間的延長，Cx43蛋白表達亦出現不同程度的下降；磷酸化的Cx43(P-Cx43)蛋白表達亦下降，而AAP10干預后可提高兩組Cx43和P-Cx43蛋白的表達。

結論: 心肌細胞在急性冷刺激時Cx43在基因和蛋白水平上表達均有不同程度的下降，P-Cx43表達亦下降，而AAP10能提高Cx43和P-Cx43蛋白的表達從而改善細胞間的傳導。

冷刺激；心肌細胞；縫隙連接蛋白43； 磷酸化；抗心律失常肽

Methods: The primary neonatal rats’ myocardial cell culture was conducted in 4 groups. Group①, the cells were normally cultured, Group②, the cells were cultured at 4℃, Group③, the cells were cultured at 0℃ and Group④, the antiarrhythmia peptide (AAP 10) was added in Group② and Group③. The apoptosis rate of myocardial cells was evaluated by flow cytometry assay, mRNA and protein expressions of CX43 were examined by RT-PCR and Western blot analysis, and CX43 phosphorylation product (P-CX43) was detected.

Results: Compared with normally cultured cells, the myocardial cell apoptosis rate was obviously increased by acute cold stress at 4℃and 0℃with time extension. The mRNA expression of Cx43 was decreased at varying degrees at 4℃and 0℃stimulation, the protein expression of Cx43 was decreased at varying degrees at 4℃and 0℃ stimulation with time extension, and P-Cx43 level was decreased. While the APP 10 intervention may obviously elevate the protein levels of Cx43 and P-Cx43.

Conclusion: Acute cold stress could reduce the protein expression of CX43 and P-CX43, while APP 10 intervention may elevate such expression and improve the cell to cell conduction in neonatal rats’ myocardial cells.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:59.)

隨著人類對環(huán)保問題認識逐漸加深，氣候多變成為當今世界的熱門話題之一，而突如其來的天氣變化如大雪和冰凍災害等極端災害天氣對人類健康帶來極大影響，使各種疾病的發(fā)病率急劇升高，尤其對心血管疾病的影響。寒冷刺激產生的應激現象對心血管系統(tǒng)的損傷受到廣泛關注[1]。在急性冷應激時對心血管系統(tǒng)的影響機制尚不明確。有報道示冷應激反應可致體內兒茶酚胺物質分泌增加，血壓升高，心率加快，心肌缺血等并由此引發(fā)的一系列病理生理改變[2]，而在許多心臟疾患中，縫隙連接蛋白的分布和功能的改變均可能影響心臟正常的電傳導[3]。在人類心肌組織中，心室肌主要以縫隙連接蛋白43（Connexin，Cx43）為主[4]；同時縫隙連接亦受多種因素的調控，如pH值、游離鈣離子濃度、神經體液因素、生長因子以及磷酸化狀態(tài)等，其磷酸化狀態(tài)的改變可影響通道的門控和縫隙連接蛋白的更新和轉運，進而影響縫隙連接細胞間傳導通訊功能[5]。

抗心律失常肽（AAP）10是一種小分子多肽，它能促進細胞間物質交換，增強心肌細胞間的電傳導[6]。目前，國內外對急性冷應激下對Cx43影響的研究甚少，具體機制不清楚；本實驗擬探討寒冷刺激對Cx43的影響，為揭示冷應激對心血管疾病的影響奠定生物學機制基礎。

1 材料與方法

動物與試劑：2011-08至2012-05采用剛出生1～3天的乳鼠若干只（由南昌大學醫(yī)學院動物房及生理實驗室提供），雌雄不限。AAP10（Gly-Aia-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH2）杭州中肽生化有限公司。使用的試劑包括：磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（主要成分：Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl ），DMEM高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶；膠原酶Ⅱ和胎牛血清（北京綠源博得生物科技公司），逆轉錄酶試劑盒（廈門慧嘉生物科技有限公司），凋亡試劑盒（深圳紐邦生物）；連接蛋白43多克隆抗體（美國ADI公司）、小鼠抗β-actin單克隆抗體（美國Chemicon公司）；辣根過氧化物酶羊抗小鼠IgG抗體及小鼠抗磷酸化的Cx43（P-Cx43）單克隆抗體（美國SantaCruz公司）等。

心肌細胞原代培養(yǎng)及冷應激模型的建立：①乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)：在消毒好的超凈臺上，將乳鼠（剛出生1～3天）第3、4肋間剪開皮膚逐層，取出完整心臟，放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中，分離筋膜和脂肪組織，洗凈血漬。然后將心臟組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm的小塊碎片。向其中加入5 ml 0.08%胰蛋白酶，吹打后用移液管把液體移入錐形瓶中，置37℃水浴箱中，搖動消化5～6 min，取出錐形瓶，吸棄上清液，此步驟重復3次后觀察心肌組織較粘稠，再往錐形瓶中加入9 ml無血清DMEM+1ml膠原酶Ⅱ放入CO2孵箱中孵育，每隔20 min搖動1次，視消化情況時間一般為1～3 h。再將消化好的錐形瓶內液體取出后加入與之等體積的15%胎牛血清DMEM10 ml，將上述20 ml液體分裝成4個離心管中，每個5 ml進行離心，1000 r/min，每次5 min。離心后，吸棄上清液，加入5 ml培養(yǎng)基，再離心，重復2次。離心好后，棄上清，先加入5 ml培養(yǎng)基吹打混勻數十次，再加5 ml培養(yǎng)基至10 ml，取出濾器將4個離心管中的液體濾出至一個大的培養(yǎng)皿中，放置CO2孵箱中進行貼壁2 h。最后取出，在顯微鏡下對心肌細胞計數，并接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。每天顯微鏡下觀察并換液。培養(yǎng)至第4～5天時，可見細胞呈簇狀生長，聚集成群，細胞活躍且搏動有力。②實驗分組及冷應激模型的建立：將培養(yǎng)的心肌細胞隨機分成3個組：正常對照組（常規(guī)培養(yǎng)），實驗4℃組（冷刺激時間為4℃1 h、3 h和6 h）、實驗0℃組（冷刺激時間為0℃10min、30 min和60 min），每組8只。冷應激模型的建立：選培養(yǎng)至5～6 d的心肌細胞，用含-25℃、95%乙醇的恒溫低溫浴槽分別將細胞凍至4℃1h、3h和6h；0℃10min、30 min和60min，然后立即于37℃水浴復溫至接近37℃，置培養(yǎng)箱內，繼續(xù)培養(yǎng)6h，建立冷應激模型[6]。

細胞凋亡率的測定：將正常對照組及實驗4℃組和實驗0℃組的心肌細胞分別用0.25%胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察消化情況，待消化好后加入DEME血清中和并吹打數次，然后以2000 r/min離心10 min，棄上清，加PBS吹打混勻，離心3次。最后加Binding buffer吹打沉淀細胞，移入5 ml離心管中，分別加Annexin V-FITC和Propidium Iodide（PI）5 μl混勻后置4℃避光30min，用流式細胞術（FCM）檢測，在激發(fā)光波長488 nm，檢測發(fā)射光波長540 nm處紅色熒光，計數10 000個細胞。

聚合酶鏈反應（PCR）檢測Cx43 mRNA的表達：提取RNA：在消毒好的超凈臺上操作，上述各組細胞分別加入Trizo 1ml，轉入EP管中，室溫放置5 min后，4℃ 12 000 r/min，離心5 min，棄沉淀；

再加入200 μl氯仿，震蕩混勻，室溫放置15 min后，4℃ 12 000 r/min 離心15 min吸取上層水相至另一EP管中，加入0.5 ml異丙醇混勻，室溫放置110 min后，再次離心10 min，棄上清，RNA沉于管底。加入1 ml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，4℃ 7 500 r/min離心10 min，盡量棄上清，室溫晾干10 min，20 μl焦碳酸二乙酯 （DEPC）水溶解RNA樣品，定量RNA濃度，取5 μl RNA樣品+逆轉錄酶+Cx43 mRNA引物（5’-GCTGGTGGTGTCCTTGGT-3’，5’-TTGGCATTCTGGTTGTCG-3’）或內參3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）組成25 μl體系， 進行逆轉錄擴增合成cDNA，反應退火溫度52℃，并制膠跑電泳，最后在凝膠成像下觀察。

蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測Cx43和P-Cx43蛋白表達：各組細胞經上述干預后，經消化、離心后收集細胞，加用RIPA裂解液1ml先裂解細胞，放置4℃、10 min后，再加入蛋白提取液0.5 ml均勻搖蕩，放置4℃、3 min后，將各組細胞蛋白分別放置已沸騰的熱水中煮5 min。制作10%的分離膠和5%的積層膠， 10 μl蛋白+5 μl緩沖液上樣至每泳道，MARK 5 μ跑電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜 （NC）膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉3次，每次約10 min，然后TBST [主要成分：8.8 g NaCl、20 ml Tric-Hcl（PH8.0）、0.5 ml Tween加入800 ml去離子水中搖勻]洗膜3次，每次10 min，洗畢后加入Cx43蛋白一抗（1：200）、抗P-Cx43蛋白（1：500）一抗和抗β-actin一抗（1：200）4℃封閉過夜，TBST溶液洗膜3次，每次10～15 min，室溫下加相應二抗（1：5 000）孵育3 h，同前法洗膜3次，用增強化學發(fā)光法進行抗原抗體顯色，X線曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)成像分析，將正常對照組灰度值設為1，其它組灰度值為與正常對照組比較得出的數據，并以內參β-actin進行對比標化。

統(tǒng)計學處理：實驗數據以均數±標準差表示，統(tǒng)計分析方法用多因素方差分析，采用SPSS 17.0軟件分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

三組心肌細胞的形態(tài)變化：原代心肌細胞種板4 h后，在倒置顯微鏡下可觀察到心肌細胞開始貼壁生長，初細胞形態(tài)為圓形，后為梭形。第1天細胞可視心肌細胞伸出較短的偽足，偶爾可見有單個搏動的心肌細胞，搏動頻率較慢，大約為20次/分，律齊；第2天部分偽足已有融合，搏動頻率有所加強，但也較緩，第4天搏動頻率明顯，約為75次/分，律齊，并且可觀察到細胞間已開始逐漸相互融合，呈片狀群體性搏動，有規(guī)律。第5～6天乳鼠心肌細胞生長旺盛，活躍，每搏頻率可達100次/分以上，律規(guī)整。心肌細胞在冷刺激時可視細胞逐漸分散，核裂解，搏動范圍縮小及頻率亦明顯緩慢。圖1

圖1 正常對照組與實驗4℃組（冷刺激時間3 h）細胞學形態(tài)鏡下比較

心肌細胞凋亡率的結果：流氏細胞術檢測實驗4℃組和實驗0℃組乳鼠心肌細胞凋亡率的結果表明[6次獨立實驗，（3～30）±（0.01～0.03）]：實驗4℃組及實驗0℃組低溫條件下，隨著溫度的下降及低溫時間延長，使心肌細胞的凋亡率增加，由（3.02±0.02）%和（6.74±0.01）%分別增加至（10.79±0.03）%和（28.52±0.03）%，與正常對照組（1.05±0.02）%相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。圖2

圖2 不同溫度實驗組心肌細胞凋亡率的變化

聚合酶鏈反應（PCR）檢測結果：加入100 nmol/L APP10處理前與加入100 nmol/L APP10 處理后，實驗4℃組和實驗0℃組Cx43 mRNA表達均較正常對照組均有不同程度的表達下降（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義；

而實驗4℃組和實驗0℃組在加入100 nmol/L APP10處理后，兩組Cx43 mRNA表達均較同組加入APP10處理前有所增加（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。表1、圖3

Western blot檢測結果： 加入APP10處理前與加入APP10處理后，實驗4℃組和實驗0℃組Cx43、 P-Cx43蛋白表達均較正常對照組有不同程度的下降（P均＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義；而在實驗4℃組和實驗0℃組均加入APP10處理后，實驗4℃組和實驗0℃組Cx43、P-Cx43蛋白表達較同組加入APP10處理前有所增加（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。表2、圖4

表1 三組APP 10處理前細胞Cx43 mRNA和APP10處理后Cx43 mRNA定量值

表1 三組APP 10處理前細胞Cx43 mRNA和APP10處理后Cx43 mRNA定量值

注：與正常對照組比*P＜0.01；與同組加入APP10處理前比△P＜0.01。Cx43：縫隙接連蛋白43 APP10：抗心律失常肽10

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表2 三組Cx43、p-Cx43蛋白表達的變化

表2 三組Cx43、p-Cx43蛋白表達的變化

注：與正常對照組比*P＜0.01；與同組加入APP10處理前比△P＜0.01。余注見表1

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圖3 逆轉錄-聚合酶鏈反應電泳圖顯示抗心律失常肽10干預對不同溫度冷應激處理條件下乳鼠心肌細胞Cx43 mRNA水平的影響

圖4 三組APP10處理前后乳鼠心肌細胞Cx43及P-Cx43蛋白表達的變化

3 討論

應激是機體應對生存環(huán)境中一種或多種不良甚至有害因素條件下所產生的全身非特異性反應，機體可表現為應對不同強度刺激下神經—內分泌系統(tǒng)增強，而作出的適應反應，主要以交感—腎上腺

髓質系統(tǒng)和下丘腦—垂體—腎上腺皮質軸（HPA）興奮為主的內分泌反應，引起機體兒茶酚胺（如腎上腺素、去甲腎上腺素）物質和糖皮質激素的分泌增多；從而活化心肌細胞膜表面的受體，并通過多種細胞信號傳導通路啟動生化級聯反應，介導細胞應激反應乃至應激損傷的發(fā)生。應激作為心血管疾病的重要誘因和病因已得到確認[7]，有學者甚至認為心血管疾病是第一應激性疾病[8]。在寒冷刺激環(huán)境中，高強度的冷暴露使機體產生應激反應，導致機體生理功能紊亂，形成損傷及相關基因和蛋白的改變[9]。目前，關于寒冷刺激對Cx43影響的研究甚少。

本研究通過觀察在不同強度及時間段給予心肌細胞急性冷刺激，發(fā)現在隨著刺激強度的增加及時間的延長，心肌細胞的凋亡率逐漸增加；并觀察到Cx43在基因及蛋白水平上的表達均有不同程度的降低，說明在急性極端條件下（冷刺激強度刺激時），易促發(fā)心肌細胞的損傷；而細胞偶聯傳導物質—Cx43在其機制中扮演著重要角色。在信號轉導過程中，可通過磷酸化快速調節(jié)效應蛋白活性和通過調節(jié)基因表達的緩慢生物效應的兩種主要作用方式傳導。連接蛋白大多數都屬于磷蛋白，它們處于不同的磷酸化水平；且磷酸化是蛋白轉錄后非常普遍的主要修飾之一；同時縫隙連接的功能受許多因素的影響。其中，在羧基末端的絲/蘇氨酸及酪氨酸殘基的磷酸化/去磷酸化水平中，它可因胞內的信號變化而改變蛋白的構象，從而對調節(jié)縫隙連接的傳導性起著至關重要的作用。但也有研究正面報道[10]，寒冷刺激可使棕色脂肪組織活性顯著增加，參與了體外心肌自發(fā)分化能力，甚至加強心臟干細胞分化，從而有效的修復受損心肌，改善心臟功能等作用；因此仍有頗多爭論。

AAP10是一種小分子多肽物質，它可以結合到一種膜蛋白受體，促進細胞間通訊和傳導功能，產生抗心律失常的作用[11]，但具體機制目前尚不清楚。本實驗觀察到在實驗4℃組和實驗0℃組加入100 nmol/L AAP10干預后，能使Cx43和P -Cx43的含量表達均有所提高，由此我們推測AAP10可能通過加強蛋白的磷酸化水平來改善細胞間的傳導。這一結果與Weng等[12]所得的結果相一致。他們采用雙探頭膜片鉗技術研究AAP10對成年豚鼠心肌細胞及轉染了Cx43細胞的縫隙連接傳導的影響，結果顯示AAP10能促進這兩種細胞間的電傳導；并且通過使用PKC阻斷劑BIM，PKCα亞型阻斷劑CGP54345等，同時使用ELISA檢測發(fā)現AAP10主要促進PKC介導的Cx43磷酸化作用來改善細胞間的傳導；也有研究報道顯示[13]，縫隙連接蛋白阻滯劑—Heptanol可使Cx43表達增加，使缺血心肌與正常心肌電傳導差異性減少，改善電重構，從而發(fā)揮預防缺血性室性心律失常的作用。

綜上所述，極端氣候條件下（急性冷應激刺激）對心肌細胞的凋亡或損傷具有顯著影響，且能使細胞間通訊傳導功能明顯下降，使Cx43和P-Cx43表達均有下降；而AAP10改善細胞間的傳導主要通過促進蛋白磷酸化水平而起作用。但至今為止，磷酸化對縫隙連接蛋白通道的調控，仍有許多問題有待進一步研究，可能涉及到許多復雜因素的參與，如縫隙連接不同的亞型、Cx43蛋白許多不同的磷酸化位點、不同的激酶和蛋白磷酸化的參與以及信號轉導途徑網的相互作用等等，且本實驗未從動物整體研究，未涉及到復雜的信號轉導機制網；因此關于磷酸化如何影響縫隙連接通道細胞間的傳導，還有待今后進一步探索和研究。

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Effect of Cold Stress on Connexin43 Protein Expression With Drug Intervention in Neonatal Rats’Myocardial Cells

HUANG Qiang-hui, HONG Kui, CHENG Xiao-shu, HU Jian-xin.
Department of Cardiology, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang (330006), Jiangxi, China

Objective: To study the effects of acute cold stress on connexin43 (Cx43) protein expression with drug intervention, and cell to cell conduction with its mechanism in neonatal rats’ myocardial cells.

Cold stress; Myocardial cells; Connexin43; Phosporylation; Anti-arrhythmia peptide

2014-04-10）

（編輯: 汪碧蓉）

330006 江西省南昌市，南昌大學第二附屬醫(yī)院 心內科

黃強輝 住院醫(yī)師 碩士 主要從事心血管病研究 Email：277066217@qq.com 通訊作者：胡建新 Email：hujianxin@medmail.com

R54

A

1000-3614( 2015 )01-0059-05

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2015.01.016