藍(lán)丹純　易　瑋　許能貴　孫　健(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東　廣州　50405)

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電針對自發(fā)性胰島素抵抗大鼠血清SOD、MDA及eNOS表達(dá)的影響

藍(lán)丹純易瑋許能貴孫健1(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405)

〔摘要〕目的探討電針對胰島素抵抗大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及主動脈一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表達(dá)的影響。方法以8只雄性LETO大鼠作為Blank組，將16只雄性O(shè)LETF大鼠隨機(jī)分為E-A組及Model組，每組8只。Blank組及Model組進(jìn)行正常飼養(yǎng)，不給予其他處理。E-A組針刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)、三陰交、足三里及腎俞，并予雙側(cè)足三里及三陰交加電。每日1次，每次20 min，持續(xù)4 w。治療結(jié)束后，禁食12 h，次晨眼眶靜脈竇采血。檢測各組大鼠空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、胰島素敏感性指數(shù)(ISI)、SOD、MDA、一氧化氮(NO)及內(nèi)皮素(ET)-1。HE染色觀察主動脈病理變化，Western印跡分析主動脈eNOS的蛋白表達(dá)。結(jié)果Model組的FPG、FINS、MDA、ET相比Blank組顯著升高(P=0. 001，P=0. 032，P=0. 000，P=0. 037)，ISI、SOD、NO較Blank組顯著降低(P=0. 001，P=0. 000，P= 0. 018)。E-A組的FPG、FINS、MDA較Model組顯著降低(P=0. 007，P=0. 001，P=0. 000)，ISI、NO相比Model組顯著升高(P=0. 000，P= 0. 016)，ET-1水平雖無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0. 05)，但有所降低。光鏡顯示，電針干預(yù)對總體病理損傷有不同程度的改善。E-A組eNOS蛋白表達(dá)明顯高于Model組(P=0. 005)。結(jié)論電針干預(yù)對胰島素抵抗及氧化應(yīng)激狀態(tài)有良性調(diào)節(jié)作用，有助于抗氧化、抗血管損傷，促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙的改善。

〔關(guān)鍵詞〕電針;胰島素抵抗;內(nèi)皮功能障礙;氧化應(yīng)激

1廣東省中醫(yī)院

第一作者:藍(lán)丹純(1988-)，女，在讀博士，主要從事針灸治病機(jī)制研究。

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病的特征之一，在出現(xiàn)臨床高血糖前就已經(jīng)存在〔1〕。血管內(nèi)皮不僅是胰島素由血液進(jìn)入靶組織的必經(jīng)之路，也是胰島素的非經(jīng)典靶組織、糖尿病血管病變的關(guān)鍵靶組織〔2〕。研究表明，IR和血管內(nèi)皮功能障礙之間相互影響，參與糖尿病大血管和微血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展，與動脈粥樣硬化、高血壓等心腦血管疾病密切相關(guān)〔3～5〕。不論是改善IR，還是調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能，針灸療法已經(jīng)得到良好的療效驗證〔6，7〕。本研究采用自發(fā)性IR模型(OLETF)大鼠進(jìn)行針刺干預(yù)治療，通過觀察超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，及反映血管舒縮功能的一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)及NO合成酶(eNOS)水平的變化，探討針刺對IR及血管功能改善的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1. 1實驗動物選用16周齡SPF級雄性O(shè)LETF大鼠16只(體重450～500 g)，LETO大鼠8只(體重400～425 g)，由Otsuka制藥公司在濱松(日本)的研究實驗室提供，合格證號: 99005800000055，使用許可證號: SYXK(粵)2013-0001。飼養(yǎng)及實驗過程均于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級環(huán)境內(nèi)。統(tǒng)一的飼料配方(質(zhì)量比):玉米31%，小麥18%，豆粕21%，稻谷4%，黃豆2%，麩皮10%，蛋黃粉3%，魚粉6%，預(yù)混料3. 5%，植物油1. 5%，多種維生素1%，由實驗動物中心提供。整個實驗過程符合實驗室動物護(hù)理和使用的倫理指導(dǎo)原則。

1. 2主要試劑及儀器SOD、MDA及NO測定試劑盒均購自南京建成公司;胰島素(FINS)測定試劑盒購自默科迪亞公司; ET-1測定試劑盒購自Assay Designs公司;抗eNOS抗體購自艾博抗公司;熒光數(shù)碼成像顯微鏡(型號: BX51T+DP72+IPP，日本奧林巴斯公司)，G6805-2A型低頻電子脈沖治療儀(YZB/滬0735-26-2009，上海華誼醫(yī)用儀器有限公司)，一次性無菌針灸針(華佗牌，規(guī)格: 0. 35 mm×13 mm)。

1. 3穴位定位(1)腎俞位于大鼠后背第二腰推下旁開5 mm;(2)足三里位于大鼠后肢膝關(guān)節(jié)外下方當(dāng)腓骨小頭下約5 mm;(3)三陰交位于大鼠后肢內(nèi)踝尖直上10 mm;(4)內(nèi)關(guān)位于前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間。

1. 4實驗分組LETO大鼠8只，為空白(Blank)組，OLETF大鼠隨機(jī)分為模型(Model)組、電針(E-A)組，每組8只。Blank組和Model組不予針刺。E-A組予以針刺干預(yù)，雙側(cè)足三里及三陰交給予電針刺激，疏密波(疏波2 Hz，密波50 Hz，調(diào)制頻率10次/min)，強(qiáng)度以大鼠后肢輕微抖動為度，20 min/次，1次/d，持續(xù)治療4 w。

1. 5標(biāo)本采集及檢測針刺療程結(jié)束后禁食不禁水12 h，次晨麻醉，眼眶靜脈竇采血。空腹血糖(FPG)測定用葡萄糖氧化酶法; FINS、ET-1測定采用ELISA法，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作; SOD、MDA及NO分別采用WST-1法、TBA法及硝酸還原酶法測定。ISI參照李光偉〔8〕的方法: ISI= 1/(FPG×FINS)，因其為偏態(tài)分布，故取自然對數(shù)比較。10%水合氯醛麻醉，截取主動脈3 mm×2 mm大小置于4%多聚甲醛固定，備HE染色光鏡觀察，余下主動脈置于－20℃保存，用于Western印跡檢測。

1. 6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19. 0軟件，采用單因素方差分析，方差齊性用LSD比較，方差不齊用Tamhane比較。

2　結(jié)果

2. 1電針對OLETF大鼠血清FPG、FINS、ISI的影響Model組的FPG、FINS相比Blank組顯著升高(P= 0. 001，P= 0. 032)，ISI較Blank組顯著降低(P = 0. 001)。E-A組的FPG、FINS較Model組顯著降低(P= 0. 007，P= 0. 001)，ISI比Model組顯著升高(P=0. 000)。見表1。

表1　各組大鼠血清FPG、FINS、ISI的影響(x ±s，n=8)

2. 2電針對OLETF大鼠血清SOD、MDA的影響Model組的SOD水平比Blank組顯著降低(P=0. 000)，MDA顯著升高(P= 0. 000)。相比Blank組，E-A組的SOD水平顯著降低(P = 0. 000)，MDA升高(P = 0. 021)。E-A組SOD水平相比Model組顯著升高(P=0. 005)，MDA顯著降低(P=0. 000)。見表2。

2. 3電針對OLETF大鼠血清NO及ET-1的影響Model組血清NO水平相比Blank組減低(P = 0. 018)，而ET-1水平升高(P=0. 037)。與Model組相比，NO水平升高(P= 0. 016)，ET-1水平雖無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0. 05)，但略降低。見表2。

表2　各組大鼠血清SOD、MDA、NO、ET-1的比較(x ±s，n=8)

2. 4電針對OLETF大鼠主動脈形態(tài)學(xué)的影響B(tài)lank組主動脈內(nèi)膜光滑完整連續(xù)，無增厚缺損，內(nèi)皮下連接緊密，血管平滑肌細(xì)胞排列整齊。而Model組血管內(nèi)膜增厚，部分連接開大、水腫，彈力纖維斷裂，部分平滑肌細(xì)胞增生肥大、排列紊亂。EA組的主動脈內(nèi)膜層尚完整，無明顯增厚，彈力纖維層、平滑肌層未見明顯紊亂，總體病理損傷有不同程度的改善。見圖1。

2. 5電針對OLETF大鼠主動脈eNOS蛋白表達(dá)的影響Model組(0. 36±0. 06)相比空白組(0. 48±0. 01)，eNOS蛋白表達(dá)明顯減少(P=0. 000)，E-A組(0. 58±0. 03)相比Blank組蛋白表達(dá)減少(P = 0. 011)，與Model組相比蛋白表達(dá)顯著增加(P = 0. 005)。見圖2。

圖1　電針對各組大鼠主動脈形態(tài)學(xué)的影響(HE染色，×200)

圖2　電針對各組大鼠主動脈eNOS蛋白表達(dá)的影響

3　討論

研究表明，糖脂代謝紊亂引起的氧化應(yīng)激與IR、血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)。在正常情況下，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的少量氧自由基能夠被體內(nèi)抗氧化酶如SOD迅速消除，保護(hù)機(jī)體免受損傷。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧產(chǎn)物生成增加，過剩的氧自由基可引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成脂質(zhì)過氧化物MDA〔9〕。而脂質(zhì)毒性又可增加脂肪組織的氧化應(yīng)激，影響線粒體功能，促進(jìn)IR，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，以此形成惡性循環(huán)。SOD活力間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA含量又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，模型組的SOD活性相比空白組明顯降低，MDA含量明顯升高，經(jīng)電針干預(yù)，電針組的SOD活性、MDA含量、IR相比模型組均得到良性調(diào)整。

NO可直接作用于血管平滑肌而舒張血管，發(fā)揮調(diào)節(jié)血壓、抑制白細(xì)胞和血小板聚集、抗血管增殖等作用。ET-1可長效縮血管、促進(jìn)血小板、單核巨噬細(xì)胞的聚集黏附。當(dāng)內(nèi)皮功能障礙時，其為損傷標(biāo)記物〔10〕。因此NO與ET-1的平衡與否影響著血管的正常舒縮功能。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧的增加是抑制eNOS活性，造成eNOS解偶聯(lián)的根本原因。eNOS解偶聯(lián)一方面使得NO生成減少，生物利用率降低，另一方面又可加重氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，電針干預(yù)后的OLETF大鼠血清NO明顯升高，主動脈eNOS蛋白表達(dá)增加，ET-1降低，主動脈總體病理損傷亦有不同程度的改善。

2型糖尿病可歸屬于“消渴”范疇，其主要病機(jī)是“本虛標(biāo)實”，具體表現(xiàn)為“脾腎兩虛，痰瘀阻絡(luò)”。本課題以“健脾益腎、活血化痰”治法，穴選補(bǔ)益腎氣，通陽利水之功的“腎俞”，益氣健脾、和胃化痰之效的“足三里”，健脾、疏肝、益腎的“三陰交”和理氣活血的“內(nèi)關(guān)”。諸穴共用，以期共奏“健脾益腎、活血化痰”之效。本研究表明，通過針灸的干預(yù)早期控制氧化應(yīng)激狀態(tài)，可改善IR狀態(tài)、改善調(diào)整血管內(nèi)皮功能、預(yù)防血管病變，對臨床治療糖尿病有重要的指導(dǎo)作用。

4參考文獻(xiàn)

1廖二元.內(nèi)分泌代謝病學(xué)〔M〕．第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2012: 1220.

2 Steinberg HO，Chaker H，Lcaming R，et al．Obesity/insulin resistance is associated with endothelial dysfunction. Implications for the syndrome of insulin resistance〔J〕．J Clin Invest，1996; 97(11): 2601-10.

3 Gonzalez MA，Selwyn AP. Endothelial function，inflammation，and prognosis in cardiovascular disease〔J〕．Am J Med，2003; 115(8): 99-106.

4龍盼，張俊峰.血管內(nèi)皮功能障礙與動脈粥樣硬化〔J〕．國際心血管病雜志，2011; 38(2): 79-81.

5趙良平，呂安康，張奇.胰島素抵抗與血管內(nèi)皮功能障礙〔J〕．國際心血管病雜志，2009; 36(1): 14-7.

6王媛，劉志誠，徐斌.針刺治療女性2型糖尿病療效分析〔J〕．中國針灸，2014; 34(1): 21-4.

7衛(wèi)彥，寇吉友，陳軍.針刺人迎穴對高血壓患者血清中血管活性物質(zhì)影響的研究〔J〕．針灸臨床雜志，2010; 26(2): 12-4.

8李光偉．胰島素敏感性評估及其在臨床研究中的應(yīng)用〔J〕．中華內(nèi)分泌代謝雜志，2000; 16(3): 198-200．

9 Bandeira Sde M，Guedes Gda S，da Fonseca LJ，et al. Characterization of blood oxidative stress in type 2 diabetes mellitus patients: increase in lipid peroxidation and SOD activity〔J〕．Oxid Med Cell Longev，2012: 819310.

10李定祥，方學(xué)杰，劉曉丹，等.急性腦梗死中醫(yī)證型與血清ET-1、vWF、H-FABP、PAO的相關(guān)性研究〔J〕．中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2014; 20(8): 1092-3.

（2014-12-22修回）
（編輯袁左鳴）

Effect of electroacupuncture on serum levels of SOD，MDA and expression of eNOS of thoracic in OLETF rats

LAN Dan-Chun，YI Wei，XU Neng-Gui，et al．
Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，Guangdong，China

【Abstract】Objective To investigate the effect of electroacupuncture(E-A)on the serum levels of superoxide dismutase(SOD)，malondialdehyde(MDA)and the expression of endothelial nitric oxide synthase(eNOS)of thoracic in OLETF rats．Methods Sixteen male OLETF rats were randomly divided into E-A and model groups，eight rats in each group．Eight male LETO rats were divided as blank group．The E-A group was applied to bilateral Neiguan(PC6)，Zusanli(ST36)，Sanyinjiao(SP6)，and Shenshu(BL23)．Needles in Zusanli(ST36)，Sanyinjiao(SP6)were connected with E-A．At the end of the experiment，glucose oxidase method，ELISA，WST-1，TBA and nitric acid deoxidize enzyme methods were used to detect the levels of fasting blood glucose(FPG)，serum insulin(FINS)，insulin sensitivity index(ISI)，ET-1，SOD，MDA and NO．The aortic pathology was observed by HE staining．The expression of eNOS was detected by Western blot．Results Compared with those of blank group，serum levels of FPG，F(xiàn)INS，MDA and ET-1 in model group were significantly increased(P = 0．001，P=0．032，P=0．000，P=0．037)，but the levels of ISI，SOD and NO were obviously decreased(P= 0．001，P= 0．000，P= 0．018)．Compared with those of model group，serum levels of FPG，F(xiàn)INS and MDA in E-A group were greatly decreased(P= 0．007，P= 0．001，P= 0．000)，the levels of ISI and NO were significantly increased(P=0．000，P=0．016)．The level of ET-1 in E-A group was lower than that of model group even though it was no statistical significance(P＞0．05)．E-A improved morphological changes of thoracic．The expression of eNOS in E-A group was significantly higher than that of model group(P=0．005)．Conclusions E-A intervention on insulin resistance and oxidative stress state has a positive adjustment which regulates oxidation resistance，prevents blood vessel damage and promotes the improvement of endothelial dysfunction．

【Key words】Electroacupuncture; Insulin resistance; Endothelium dysfunction; Oxidative stress

通訊作者:易瑋(1966-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事針灸治療代謝性疾病研究。

基金項目:國家自然科學(xué)基金項目資助(No．81273845)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5703-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 010

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔中圖分類號〕R245. 31+1