王世英　時(shí)　軍　陳寶平　(河南大學(xué)淮河醫(yī)院，河南　開(kāi)封　475000)

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活性維生素D對(duì)糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞損傷的抑制效果及其可能機(jī)制

王世英時(shí)軍陳寶平(河南大學(xué)淮河醫(yī)院，河南開(kāi)封475000)

〔摘要〕目的探討活性維生素D對(duì)糖尿病腎病(DN)大鼠足細(xì)胞損傷的抑制效果及其可能機(jī)制。方法將48只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、正常大鼠給予活性維生素D干預(yù)組(VD組)、DN模型組(DN組)、給予活性維生素D干預(yù)的DN模型組(DN+VD組)，每組10只。定期收集血、尿標(biāo)本，18 w末處死，檢測(cè)尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、尿蛋白水平;分別采用過(guò)碘酸雪夫(PAS)、Mssson染色觀察腎組織病理改變，電鏡下觀察足細(xì)胞改變。免疫組化檢測(cè)腎組織VDR和相關(guān)蛋白表達(dá)情況。Western印跡分析相關(guān)蛋白表達(dá)與PI3K/p-Akt信號(hào)通路的關(guān)系。結(jié)果造模后6～18 w，與NC組、VD組相比，DN組尿蛋白量明顯上升(P＜0. 05)，在給予VD干預(yù)后18 w結(jié)束時(shí)約降低37%。造模18 w后，DN組腎質(zhì)量體質(zhì)量比明顯高于NC組和VD組(P＜0. 05)，給予VD干預(yù)后明顯下降。DN組、DN+VD組血BUN水平明顯高于NC組和VD組(P＜0. 05)。NC組和VD組高表達(dá)Podocin和Nephrin，DN組大鼠以上兩種蛋白表達(dá)明顯減少; NC組大鼠低表達(dá)Desmin，DN組大鼠表達(dá)明顯增加。給予VD干預(yù)后Podocin和Nephrin表達(dá)均明顯高于DN組，但仍明顯低于NC組和VD組; Desmin表達(dá)明顯低于DN組。DN組大鼠VDR表達(dá)水平明顯低于NC組和VD組，給予VD干預(yù)后表達(dá)水平明顯上升。DN組大鼠腎組織PI3K-p85表白水平明顯低于NC組和VD組，給予VD干預(yù)后表達(dá)水平明顯上升。四組間總Akt水平無(wú)明顯差異，但DN組p-Akt水平表達(dá)明顯降低，經(jīng)VD干預(yù)后明顯上升。相關(guān)性分析顯示，Nephrin與VDR、PI3K-p85、p-Akt之間均呈明顯的正相關(guān)。結(jié)論活性維生素D可有效抑制鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的DN大鼠足細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與影響PI3K/p-Akt信號(hào)通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕糖尿病腎病;活性維生素D;足細(xì)胞;機(jī)制

糖尿病腎病(DN)病情發(fā)展中足細(xì)胞損傷是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，但其機(jī)制目前仍未完全明確。足細(xì)胞中存在特殊的足突結(jié)構(gòu)，且足突彼此相連也依賴(lài)于裂孔膈膜蛋白。研究顯示足細(xì)胞裂孔膈膜蛋白Podocin、Nephrin等表達(dá)異常為足細(xì)胞早期損傷的一個(gè)特異性標(biāo)志，同時(shí)Nephrin還是重要的信號(hào)蛋白〔1〕。有研究顯示，在某些疾病狀態(tài)下，通過(guò)穩(wěn)定PI3K/p-Akt信號(hào)通路能夠有效緩解足細(xì)胞受損，降低蛋白尿發(fā)生率〔2〕。本文旨在研究活性維生素D對(duì)DN大鼠足細(xì)胞損傷的抑制作用，并探討活性維生素D是否通過(guò)穩(wěn)定PI3K/p-Akt信號(hào)通路來(lái)抑制足細(xì)胞損傷。

1　材料與方法

1. 1材料健康清潔級(jí)Wistar雄性大鼠40只，質(zhì)量170～190 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào): SCXK(滬): 2007-0005?；钚跃S生素D3(上海羅氏制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20100056)。鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)，血糖檢測(cè)儀(德國(guó)羅氏)，兔抗大鼠VDR及Podocin多克隆抗體(美國(guó)Bioss公司)，兔抗大鼠Nephrin、Desmin、PI3K-p85、Akt、p-Akt多克隆抗體(美國(guó)Immunoway公司)，免疫組化試劑盒(上海金標(biāo)生物科技有限公司)。

1. 2研究方法

1. 2. 1模型建立與分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，禁食自由飲食12 h，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、正常大鼠給予活性維生素D干預(yù)組(VD組)、DN模型組(DN組)、給予活性維生素D干預(yù)的DN模型組(DN+VD組)，每組10只。DN組大鼠給予60 mg/kg STZ一次性腹腔注射建模，3 d后檢測(cè)血糖水平＞16. 7 mmol/L說(shuō)明造模成功; NC組給予等量生理鹽水腹腔注射。造模成功后第2天，VD組給予花生油為溶劑的骨化三醇溶液0. 1 μg·kd－1·d－1灌胃，其余兩組給予等量花生油灌胃。

1. 2. 2樣本收集與檢測(cè)模型建立后每2 w檢測(cè)1次大鼠體質(zhì)量和血糖水平，每3 w收集24 h尿液。在第18周結(jié)束時(shí)處死大鼠，留取血液樣本和腎組織標(biāo)本。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血鈣(Ca)、血磷(P)、血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)水平，采用馬斯亮藍(lán)法測(cè)定24 h尿蛋白量水平。

1. 2. 3腎臟組織病理學(xué)檢查腎臟組織采用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后進(jìn)行切片和過(guò)碘酸雪夫(PAS)染色、Mssson染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)改變。采用Image-Pro6. 0軟件計(jì)算腎小球面積和系膜基質(zhì)增生面積。每張切片均隨機(jī)取30個(gè)聯(lián)系不重復(fù)的腎小球，進(jìn)行腎臟損傷評(píng)分。經(jīng)3. 0%戊二醛固定、制片，在電鏡下觀察腎小球足突和基底膜的變化。

1. 2. 4免疫組織化學(xué)將石蠟切片脫蠟水化，微波對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)，免疫組化染色(SP)法使用免疫組化試劑盒檢測(cè)VDR、Podocin、Nephrin、Desmin的表達(dá)。操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每張切片均隨機(jī)取30個(gè)不同的腎小球視野，進(jìn)行半定量分析:無(wú)色(－)、淡黃色(+)、棕黃色()、棕褐色()。依據(jù)免疫組化反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

1. 2. 5 Western印跡分析取適量液氮凍存的腎皮質(zhì)，加入含磷酸酶抑制劑和蛋白酶的裂解液，超聲破碎后在4℃條件下2 000 r/min離心30 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量的組織蛋白，90℃溫度下變性5 min，10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳后按濕轉(zhuǎn)法將產(chǎn)物轉(zhuǎn)印到聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，使用含10%的脫脂牛奶室溫條件下封閉60 min，之后采用0. 5%Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，分別于本次研究中選用的抗體在4℃條件下孵育過(guò)夜，洗膜后加入標(biāo)記的二抗在室溫條件下孵育60 min，洗膜后采用增加化學(xué)發(fā)光法(ECL)處理后用凝膠定量分析系統(tǒng)測(cè)量蛋白條帶吸光度。以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18. 0軟件進(jìn)行方差分析和Pearson分析。

2　結(jié)果

2. 1大鼠血、尿指標(biāo)變化情況造模后6～18 w，與NC組、VD組相比，DN組尿蛋白量明顯上升(P＜0. 05)，在給予VD干預(yù)后明顯下降，18 w結(jié)束時(shí)約降低37%，但仍明顯高于NC組(P＜0. 05)。造模18 w后，DN組腎質(zhì)量體質(zhì)量比明顯高于NC組和VD組(P＜0. 05)，在給予VD干預(yù)后明顯下降，但仍高于NC組和VD組。NC組與VD組之間血BUN水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0. 05); DN組、DN+VD組血BUN水平明顯高于NC組和VD組(P＜0. 05)。血鈣、血磷、血Scr等指標(biāo)四組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0. 05)。

2. 2大鼠腎組織病理學(xué)改變PAS染色顯示，DN組大鼠腎小球肥大伴系膜基質(zhì)明顯增生，在給予VD干預(yù)后病變情況明顯減輕。Masson染色顯示，四組大鼠腎組織慢性化損傷指標(biāo)之間無(wú)明顯差異。電鏡觀察顯示，DN組大鼠腎小球足突出現(xiàn)融合，基底膜厚度增加，DN+VD組以上病變明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1　四組大鼠腎組織病理學(xué)改變

PAS、Masson染色(×400); EM(×10 000)

2. 3大鼠腎組織足細(xì)胞Podocin、Nephrin、Desmin表達(dá)情況SP法顯示，NC組和VD組高表達(dá)Podocin和Nephrin，DN組大鼠以上兩種蛋白表達(dá)明顯減少; NC組大鼠低表達(dá)Desmin，DN組大鼠表達(dá)明顯增加。免疫組化半定量和Western印跡分析顯示，給予VD干預(yù)后Podocin和Nephrin表達(dá)均明顯高于DN組，但仍明顯低于NC組和VD組; Desmin表達(dá)明顯低于DN組。見(jiàn)圖2。

圖2　四組大鼠腎組織足細(xì)胞Podocin、Nephrin、Desmin表達(dá)

2. 4大鼠腎組織中VDR表達(dá)情況NC組大鼠腎組織中VDR主要在足細(xì)胞表達(dá)，DN組大鼠VDR表達(dá)水平明顯低于NC組和VD組，給予VD干預(yù)后表達(dá)水平明顯上升。見(jiàn)圖3。

圖3　四組大鼠腎組織中VDR表達(dá)

2. 5維生素D對(duì)大鼠腎組織PI3K/p-Akt信號(hào)通路影響DN組大鼠腎組織PI3K-p85表白水平明顯低于NC組和VD組，給予VD干預(yù)后表達(dá)水平明顯上升。四組間總Akt水平無(wú)明顯差異，但DN組p-Akt水平表達(dá)明顯降低，經(jīng)VD干預(yù)后明顯上升。見(jiàn)圖4。

圖4　四組大鼠腎組織PI3K-p85、Akt、p-Akt表達(dá)

2. 6 Nephrin與VDR、PI3K、p-Akt相關(guān)性分析Pearson分析顯示，Nephrin與VDR、PI3K-p85、p-Akt之間均呈明顯的正相關(guān)(r=0. 787、0. 747、0. 866，P=0. 029、0. 031、0. 016)。

3　討論

目前研究顯示，活性維生素D除具有調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣、磷離子和骨代謝之外，還對(duì)內(nèi)分泌、神經(jīng)、生殖、免疫等多方面發(fā)揮著重要的生理功能，其可有效降低慢性腎臟疾病患者的尿蛋白水平〔3〕。在2型糖尿病患者中活性維生素D缺乏為治療預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，相關(guān)動(dòng)物研究也顯示，維生素D干預(yù)后可明顯降低尿蛋白水平，減少足細(xì)胞損失〔4〕。但目前為止維生素D對(duì)腎臟的上述保護(hù)作用的機(jī)制仍未明確。

有研究顯示，腎小球足細(xì)胞受損為DN早期主要的分子病理學(xué)特征，其中足細(xì)胞損失相關(guān)蛋白Podocin、Nephrin的非正常表達(dá)為特征性標(biāo)志〔5〕。本研究說(shuō)明DN大鼠存在明顯的足細(xì)胞損傷。另外維生素D可有效抑制DN大鼠的足細(xì)胞損傷，但相關(guān)作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。本次研究中活性維生素D未對(duì)DN大鼠血Scr、BUN產(chǎn)生明顯影響，其可能與Scr、BUN的改變受多因素影響有關(guān)。

Nephrin為一種有信號(hào)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白功能的腎組織足細(xì)胞特異分子，其異常表達(dá)會(huì)在一些病理狀態(tài)下隨著足細(xì)胞表型和蛋白尿的改變而變化〔6〕。本研究進(jìn)一步證實(shí)了DN早期腎組織足細(xì)胞損傷中存在明顯的PI3K/p-Akt信號(hào)通路下調(diào)，而活性維生素D對(duì)足細(xì)胞受損的抑制效果可能與上調(diào)該通路有關(guān)。

活性維生素D常通過(guò)與VDR結(jié)合發(fā)揮作用。機(jī)體中存在細(xì)胞核的細(xì)胞均能夠表達(dá)VDR，其中在肺、結(jié)腸等部位的淋巴細(xì)胞和細(xì)胞中表達(dá)量較高，足細(xì)胞同樣也能夠表達(dá)VDR〔7〕。本研究說(shuō)明活性維生素D減輕足細(xì)胞受損可能與上調(diào)VDR的表達(dá)有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-02-17修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:陳寶平(1958-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腎病研究。

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)20-5700-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 009

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R587. 2

第一作者:王世英(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腎病研究。