雷林瑜，陸鵬，解寒冰，余江濤，李道明

（1.河南省鄭州人民醫(yī)院普通外科，河南 鄭州，450003；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052）

·臨床論著·

原發(fā)性肝癌患者外周血輔助性T細(xì)胞17及白介素17水平的臨床意義

雷林瑜1，陸鵬1，解寒冰1，余江濤1，李道明2

（1.河南省鄭州人民醫(yī)院普通外科，河南 鄭州，450003；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052）

目的觀察原發(fā)性肝癌（PHC）患者外周血中輔助性T細(xì)胞17（Th17）與細(xì)胞因子白介素17（IL-17）的分泌水平，探討Th17細(xì)胞及IL-17與PHC病理發(fā)展的關(guān)系。方法選取PHC患者80例以同期40例健康體檢健康者作為對照組，收集兩組的外周血后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞亞群的比例，ELISA法檢測血清中的IL-17水平，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子RORγT mRNA水平，并分析RORγT表達(dá)水平與PHC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果PHC患者外周血中Th17占CD4+T細(xì)胞比例為（4.09±0.33）%，顯著高于對照組（1.38±0.27）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PHC患者外周血中IL-17水平為（57.73±6.21）pg/ml，顯著高于對照組（33.98±4.47）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PHC患者外周血轉(zhuǎn)錄因子RORγT mRNA水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。肝癌組織中RORγT mRNA的表達(dá)水平與肝癌組織Edmondson病理分級(jí)顯著相關(guān)（r=0.685，P＜0.05），且外周血中RORγT mRNA表達(dá)水平與HCC分化程度顯著正相關(guān)（r=0.603，P＜0.05）。結(jié)論Th17及IL-17及轉(zhuǎn)錄因子RORγT mRNA水平在PHC患者外周血表達(dá)增加，且RORγT與PHC的病理分級(jí)程度明顯相關(guān)。

肝癌；RORγT；輔助性T細(xì)胞17；白介素17

原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是世界上最常見的5大惡性腫瘤之一，常發(fā)生于肝細(xì)胞和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，其中90%以上為肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[1]。由于其手術(shù)為主的綜合治療效果不理想，近年來，免疫學(xué)治療肝細(xì)胞性肝癌越來越受到臨床的重視。

初始CD4+T細(xì)胞在不同的抗原作用下可以活化分化為不同的細(xì)胞亞型，主要包括Th1、Th2、Th17、Treg等細(xì)胞群[2]。其中，輔助性T細(xì)胞17（T helper cell17，Th17）是一群以分泌白介素17（interleukin 17，IL-17）為主要特征的細(xì)胞，它在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病中發(fā)揮著重要的作用[3-5]。此外，Th17細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化、移植排斥反應(yīng)中亦發(fā)揮著極其重要的功能[6-7]。然而，Th17及分泌的IL-17與PHC的關(guān)系尚少有研究。因此，本研究旨在觀察PHC患者Th17細(xì)胞及其分泌的因子IL-17的水平，探討RORγT在PHC患者的病理中可能發(fā)揮的功能。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2010年1月-2013年12月在鄭州人民醫(yī)院確診為PHC患者80例為肝癌組，選取同期40例健康體檢健康者作為對照組。研究組中，男43例，女37例，年齡62～76歲，平均（63.13±7.21）歲；對照組男21例，女19例，年齡59～79歲，平均（62.28± 7.85）歲。兩組患者的一般資料如性別、年齡等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。PHC患者術(shù)前均未行放射、化療及射頻消融治療，組織標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為肝細(xì)胞癌。所有標(biāo)本于術(shù)中離體30 min內(nèi)取材，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片備用。PHC組織根據(jù)Edmondson標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)[5]：Ⅰ級(jí)16例，Ⅱ級(jí)24例，Ⅲ級(jí)22例，Ⅳ級(jí)18例。

1.2 主要試劑

大鼠抗人CD3e-APC、大鼠抗人CD4-FITC、大鼠抗人IL-17-PE等流式抗體均購自Biolegend公司。破膜固定劑（Fix/Perm Cell Permeabilization Kit）購自上海英駿公司。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（Golgi Stop）購自BD公司。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)用的不完全1640培養(yǎng)液、胎牛血清以及青霉素-鏈霉素（武漢博士德公司）按照89∶10∶1比例配制成完全1640培養(yǎng)液。RNA提取試劑試劑Trizol購于美國Gibco公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Femantes公司。

1.3 方法

分別于清晨抽取PHC患者以及正常對照組人群的空腹血，按以下方法處理：

1.3.1 流式染色Th17細(xì)胞：外周血紅細(xì)胞裂解后以完全1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)濃度至1×106細(xì)胞/ml。在反應(yīng)體系中加入0.8μg/ml PMA、40μg/ml離子霉素及1μl/ml Golgistop，置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。然后用3 ml PBS洗1遍并重懸于100μl PBS中，加入CD3e-APC（0.08 mg/ml）和CD4-FITC（0.4 mg/ml）抗體，混勻后置于室溫避光孵育20 min。以3 ml PBS洗1遍，加入100μl Fix/Perm A液并于室溫避光孵育20 min。離心清洗后加入100μl Fix/Perm B液重懸細(xì)胞后，再加入抗IL-17-PE（0.1 mg/ml）抗體，置4℃避光孵育30 min。以PBS緩沖液洗1遍后，以500μl PBS緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，美國BD公司）檢測。

1.3.2 ELISA及RT-PCR法檢測血清中IL-17水平清晨空腹時(shí)抽取各實(shí)驗(yàn)對象外周靜脈血5 ml，加入EDTA抗凝劑，2h內(nèi)于4℃，4000g，離心20min，離心后提取上層血清備用。IL-17的ELISA試劑盒購自eBioscience公司，檢測流程嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

取約200μl血漿，加入1 ml Trizol（南京生興公司）充分勻漿后，按照說明書的要求抽提總RNA，所得RNA溶于20μl DEPC處理水。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。進(jìn)一步采用Femantes逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對所得RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。采用RT-PCR法檢測外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT。PCR反應(yīng)條件：94℃變性5 min后擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為：94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸7 min。RORγT引物序列：F：5'-GCAATGGAAGTGGTGCTG GTT-3'，R：5'-AGGATGCTTTGGCGATGAGTC-3'；內(nèi)參GAPDH引物序列：F：5'-ATCTGGCACCACACCTT C-3'，R：5'-AGCCAGGTCCAGACGCA-3'。采用ABI公司的7900型號(hào)Real-Time PCR儀器進(jìn)行PC分析，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHC患者與正常人群外周血Th17水平比較

對照組人群中外周血中Th17比例為（1.38± 0.27）%，顯著低于PHC患者的（4.09±0.33）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.57，P=0.000），提示外周血Th17細(xì)胞的增加可作為原發(fā)性肝癌患者的預(yù)測指標(biāo)。見圖1A、1B。

圖1 兩組人群外周血Th17細(xì)胞比較

2.2 PHC患者與正常人群血清中IL-17水平比較

進(jìn)一步對Th17分泌的IL-17水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組外周血中IL-17水平為（33.98± 4.47）pg/ml，顯著低于PHC患者外周血中的（57.73± 6.21）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.54，P=0.000），提示IL-17在PHC患者的發(fā)病發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。見圖2。

圖2 兩組人群外周血中IL-17的表達(dá)水平

2.3 PHC患者與正常人群血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT mRNA水平比較

PHC患者外周血轉(zhuǎn)錄因子RORγT mRNA水平（4.43±0.89）顯著高于對照組人群（1.23±0.28），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.74，P=0.000），表明PHC患者外周血中Th17水平升高可能是由于轉(zhuǎn)錄因子RORγT mRNA水平增加所致。見圖3。

圖3 兩組患者外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT mRNA水平

2.4 PHC患者組織及血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT表達(dá)水平與肝癌組織病理分級(jí)的相關(guān)性

相關(guān)分析結(jié)果顯示肝癌組織中RORγT mRNA表達(dá)水平與PHC分化程度正相關(guān)（r=0.685，P= 0.02）；外周血中RORγT mRNA表達(dá)水平亦與HCC分化程度正相關(guān)（r=0.603，P=0.03）。見附表。

附表 PHC組織、血漿中RORγT mRNA表達(dá)與HCC分化程度的關(guān)系（±s）

附表 PHC組織、血漿中RORγT mRNA表達(dá)與HCC分化程度的關(guān)系（±s）

HCC分級(jí)n肝癌組織血漿Ⅰ162.27±1.262.97±1.42Ⅱ243.29±1.353.75±1.48Ⅲ224.49±1.214.49±1.37Ⅳ186.51±1.175.82±1.61

3 討論

原發(fā)性肝癌是世界上最常見、惡性程度極高的腫瘤之一。研究認(rèn)為PHC的發(fā)病率在世界上排名第5位，死亡率排在第3位，如果患者得不到有效的治療，生存期一般為3～6個(gè)月[8]。肝癌患者體內(nèi)的細(xì)胞免疫功能對控制肝癌的發(fā)生和發(fā)展有著極其重要的意義[9-10]。Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞中一種重要的亞群，大量的研究表明，Th17在酒精性肝病、非酒精性肝病以及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用。此外，Th17細(xì)胞在腫瘤免疫中的研究亦有報(bào)道，在卵巢癌、黑色素瘤患者中Th17細(xì)胞顯著增加[11-12]，然而，目前關(guān)于Th17細(xì)胞和肝癌的關(guān)系尚少有研究報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常人群相比較，PHC患者外周血中Th17細(xì)胞明顯升高，提示PHC患者的腫瘤微環(huán)境可能參與影響Th17細(xì)胞的分化及功能。ZHANG等[13]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞在肝癌腫瘤組織中的水平顯著高于癌旁組織，高水平的Th17細(xì)胞是肝癌患者預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，腫瘤內(nèi)的Th17細(xì)胞與腫瘤的微血管密度呈正相關(guān)，這均提示Th17細(xì)胞具有潛在的促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的功能。IL-17主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，它可以通過與多種細(xì)胞表面的IL-17受體結(jié)合后激活I(lǐng)L-17信號(hào)，從而通過釋放多種細(xì)胞因子、趨化因子以及炎性介質(zhì)，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PHC患者外周血中IL-17明顯高于正常人群，表明PHC患者的腫瘤微環(huán)境可能通過促進(jìn)Th17細(xì)胞分泌IL-17來發(fā)揮生物學(xué)功能。大量研究發(fā)現(xiàn)，RORγT是促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的最主要的轉(zhuǎn)錄因子[15]，RORγT的表達(dá)依賴于IL-6和TGF-β[16]。本研究結(jié)果顯示，PHC患者外周血中RORγT明顯高于正常人群，提示RORγT在PHC發(fā)病中可能起到極大的作用。由于原發(fā)性肝癌是一種典型的慢性炎癥為主的惡性腫瘤，因此，炎癥因子在其進(jìn)展中作用極其重要。以往有研究表明，STAT3信號(hào)的激活以及炎癥因子IL-23等是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵性的因素[17-18]。此外，本研究首次發(fā)現(xiàn)肝癌組織中轉(zhuǎn)錄因子RORγT表達(dá)水平與PHC患者組織的分化程度顯著正相關(guān)，且外周血中RORγT表達(dá)水平亦與HCC分化程度顯著正相關(guān)。王維維等[19]從細(xì)胞水平層面上認(rèn)為肝癌病理與外周血中Th17細(xì)胞相關(guān)，本研究的結(jié)果進(jìn)一步從分子水平發(fā)現(xiàn)了Th17相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子RORγT與病理的密切聯(lián)系，從而系統(tǒng)地說明了Th17細(xì)胞、相關(guān)因子及其轉(zhuǎn)錄因子在原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的功能。

綜上所述，PHC患者外周血Th17細(xì)胞及其因子IL-17、轉(zhuǎn)錄因子RORγT的水平均明顯升高，Th17細(xì)胞可能在PHC的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，對PHC治療方法的探討有一定的指導(dǎo)意義。

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（張蕾 編輯）

Clinical significance of T helper 17 cells and related IL-17 level in patients with primary liver cancer

Lin-yu LEI1,Peng LU1,Han-bing XIE1,Jiang-tao YU1,Dao-ming LI2
(1.Department of General Surgery,Zhengzhou People's Hospital,Zhengzhou,Henan 450003,P.R.China;2.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital, Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,P.R.China)

【Objective】To observe the T helper 17(Th17)cells and interleukin 17(IL-17)level in primary hepatocarcinoma(PHC),and explore the relationship between Th17/IL-17 and pathological development of PHC.【Methods】A total of 80 cases of PHC were collected as study group and 40 cases of healthy sunjects as control group.Th17 cells in peripheral blood were analyzed by flow cytometry.Serum IL-17 level was detected by ELISA,and the transcription factor ROR γ T mRNA level was detected by RT-PCR.The relationship between PHC ROR γ T and clinicopathological features was also analyzed.【Results】The percentage of Th17 cells in peripheral blood of the PHC patients[(4.09±0.33)%]was significantly higher than that in the controls[(1.38±0.27)%],the difference was statistically significant(P＜0.05).The IL-17 level in the PHC patients[(57.73±6.21)pg/ml]was also significantly higher than that in the controls[(33.98±4.47)pg/ml,P＜0.05].The level of ROR γ T mRNA in peripheral blood of the PHC patients was significantly higher than that of the controls(P＜0.001).ROR γ T mRNA expression in the PHC tissue was significantly correlated with the Edmondson pathological grade(r=0.685,P＜0.05),and ROR γ T mRNA expression in peripheral blood waspositively correlated with the degree of PHC differentiation(r=0.603,P＜0.05).【Conclusions】Th17 cells, IL-17 and ROR γ T mRNA levels are increased in peripheral blood of PHC patients,and ROR γ T mRNA expression is significantly correlated with the pathological grade of PHC,suggesting ROR γ T as latent factor in PHC diagnosis.

hepatocellular carcinoma；ROR γ T；T helper 17 cell；interleukin 17；TGF-β

R735.7

A

1005-8982（2015）30-0040-05

2015-03-05

李道明，E-mail：lidaoming@zzu.edu.cn