徐健，馮豐，劉閨男

(1.遼寧省沈陽市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110041；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001)

·論著·

小干擾RNA沉默骨橋蛋白對球囊損傷大鼠頸動脈后基質金屬蛋白酶-2及基質金屬蛋白酶-14的影響*

徐健1，馮豐1，劉閨男2

(1.遼寧省沈陽市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110041；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001)

目的觀察經(jīng)動脈外膜轉染骨橋蛋白（OPN）的小干擾RNA對大鼠頸動脈損傷后內(nèi)膜增生及基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-14（MMP-14）表達的影響，并初步探討OPN-siRNA-002抑制球囊損傷后內(nèi)膜增生的機制。方法以前期細胞實驗篩選出的最敏感的OPN-siRNA-002序列作為動物實驗轉染基因，在轉染試劑聚醚膠介導下，經(jīng)血管外膜轉染OPN-siRNA-002，于術后不同的實驗終點處死大鼠，檢測內(nèi)膜增生程度及OPN、MMP-2、MMP-14的表達變化，以及OPN-siRNA-002對它們的抑制作用。結果OPN-siRNA-002組內(nèi)膜增生顯著減輕，OPN、MMP-2、MMP-14的表達減少，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。結論OPN-siRNA-002可能通過特異性抑制OPN的表達，進而抑制MMP-2、MMP-14的表達，減輕血管損傷后內(nèi)膜的增生。

骨橋蛋白；小干擾RNA；血管再狹窄；基因轉染；大鼠

隨著生活節(jié)奏的加快，生活方式的改變及人口老齡化，冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑陌l(fā)病率也愈來愈高，成為造成死亡的主要原因之一。近幾十年來，隨著冠狀動脈內(nèi)介入技術的不斷成熟與發(fā)展，越來越多的冠心病患者都得到有效治療。但經(jīng)皮冠狀動脈成形（percutaneous transluminal coronaryangioplasty，PTCA）術后再狹窄（restenosis，RS）的發(fā)生嚴重地影響其遠期療效。上世紀90年代中期以來進行包括PTCA、冠脈斑塊切除、斑塊旋切和激光血管成形術等腔內(nèi)物理治療的臨床試驗，但其預防和治療效果令人失望[1-4]。目前多數(shù)學者認為，RS包括內(nèi)膜增生、血管重塑和血栓形成3個相互聯(lián)系而又獨立的環(huán)節(jié)[5]。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中一種重要的功能性蛋白，在大鼠血管損傷的增生內(nèi)膜中，它的表達迅速明顯增加，調節(jié)血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖和遷移，因而被認為是VSMC表型轉化的標志性基因[6]。有大量實驗證明，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一類蛋白酶家族，血管損傷后表達明顯增加，在動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）增厚的內(nèi)膜中表達水平顯著增加，并與病變程度相關[7]。本文擬通過球囊損傷的方法制備大鼠頸動脈內(nèi)膜損傷模型，在體局部轉染OPN-siRNA，觀察轉染OPN-siRNA對損傷血管局部OPN的表達、MMPs的表達及抑制血管內(nèi)膜增生的作用，來初步探討OPN-siRNA抑制血管內(nèi)膜增生的可能機制，從而為基因治療RS提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大白鼠由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，導管2 F Fogarty購自美國Baxter health corporation，OPN兔抗大鼠多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology USA，MMP-2、MMP-14兔抗大鼠多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，總RTPCR提取試劑盒、RT-PCR逆轉錄試劑盒、RT-PCR引物購自大連寶生物工程有限公司，根據(jù)GeneBank信息，確定大鼠OPN cDNA序列（NM_012881），合成3對可能有效的OPN-siRNA（委托廣州銳博生物科技有限公司合成）。通過筆者之前的研究[8]，應用實時RT-PCR檢測OPN-mRNA的表達水平，選擇其中沉默效果最好的siRNA序列-Si-r-OPN_002，進行動物實驗。正向引物：（5'-3'）5'-GGAUGAAUC UGACGAAUCUDTDT-3'；反向引物：（3'-5'）3'-DTDT CCUACUUAGACUGCUUAGA-5'。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組72只Wistar大白鼠隨機分為4組，每組18只。①假手術組：分離出左頸總動脈后，不作球囊拉傷處理；②聚醚對照組：左頸總動脈球囊拉傷后，30%的聚醚（pluronic）200μl凝膠溶液注射于頸動脈損傷部位周圍；③OPN-SCR-siRNA對照組：左頸總動脈球囊拉傷后，含OPN-scramble-siRNA 15μg的30%聚醚膠（pluronic gel）的200μl溶液注射于頸動脈損傷部位周圍；④OPN-siRNA-002治療組：左頸總動脈球囊拉傷后，含OPN-siRNA-002 15μg的30%pluronic gel的200μl溶液注射于頸動脈損傷部位周圍。

1.2.2 大鼠頸動脈損傷模型的建立Wistar大鼠，體重350～400 g，10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉后，頸正中切開，鈍性分離左頸總動脈，用血管夾臨時阻斷左頸總動脈近心、遠心端血流，應用2 F Fogarty球囊導管從頸外動脈插入左頸總動脈內(nèi)，注入生理鹽水，反復全程抽拉球囊，重復3次，造成左頸總動脈內(nèi)膜損傷。術后結扎頸外動脈，恢復血流。分別于術后的不同的實驗終點分批處死動物。取出左頸總動脈，分別置于4%多聚甲醛和液氮中，用于HE染色、免疫組織化學、Western blot及實時RT-PCR檢測。

1.2.3 在體OPN-siRNA轉染左頸總動脈球囊拉傷后，結扎頸外動脈，將200μl轉染復合物（含有Cy3-OPN-SCR-siRNA 15μg的30%pluronic gel溶液）注射于頸動脈損傷部位周圍，縫合頸部創(chuàng)口。轉染72 h后，即取大鼠損傷段局部血管，放入液氮罐中，制成冷凍切片（片厚5μm），避光置于熒光顯微鏡下。

1.2.4 血管病理形態(tài)學檢測病變血管標本經(jīng)石蠟包埋后，從每段血管的橫截面隨機切下3張切片后，利用HE染色在光學顯微鏡下觀察其內(nèi)膜增生情況，并利用計算機圖像分析系統(tǒng)，檢測血管內(nèi)膜、中膜厚度的改變，計算內(nèi)膜/中膜（I/M）的面積比。

1.2.5 免疫組織化學檢查將頸總動脈制成4μm的切片，采用SABC法進行免疫組織化學染色，加DAB顯色，蘇木素復染。以胞漿見棕黃色顆粒為陽性，一組切片標本用PBS代替一抗作為空白對照組。

1.2.6 實時RT-PCR法檢測血管壁組織的OPN、MMP-2和MMP-14 mRNA表達采用Trizol一步法提取頸總動脈的總RNA。取各組總RNA 3μl逆轉錄合成cDNA，逆轉錄反應根據(jù)逆轉錄試劑盒要求的標準進行，反應總體積為20μl，反應條件為37℃、15 min，85℃、5 s，4℃、7 min。應用ABI 7500擴增儀進行PCR擴增反應，20μl反應體系組成如下：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2X）10μl，PCR正向引物（10μmol）0.8μl，PCR反向引物（10μmol）0.8μl，ROX Reference DyeⅡ0.4μl，cDNA模板2μl，dH2O 6μl。反應條件為：95℃活化30 s，95℃變性5 s，然后60℃退火和延展30 s，共40個循環(huán)。引物序列和擴增產(chǎn)物長度見表1。β-肌動蛋白作為參考。按2-△△（T）法計算目的基因相對于對照基因的表達量[9]。實驗重復3次，取均值。

1.2.7 Western blot法檢測血管壁組織的OPN、MMP-2和MMP-14的蛋白表達提取各組動脈總蛋白后，并將蛋白濃度調至同一水平，每孔加樣80μg，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗OPN（1∶400）、MMP-2（1∶400）和MMP-14（1∶400），4℃孵育過夜。洗膜3次，加入辣根過氧化酶標記的二抗孵育，顯色2～5 min，凝膠成像分析系統(tǒng)測定條帶的平均積分光密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，運用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 實時RT-PCR引物序列和擴增產(chǎn)物長度

2 結果

2.1 在體OPN-siRNA轉染效果觀察

轉染Cy3標記的SCR-siRNA 72 h后，將轉染局部血管制成5μm厚的冷凍切片置于熒光顯微鏡下，可以發(fā)現(xiàn)，殘存血管外膜下、中膜及內(nèi)膜下均有紅色熒光分布，以中膜最為明顯，說明轉染效果滿意（見圖1）。

圖1 在體OPN-siRNA轉染效果（×400）

2.2 血管病理形態(tài)學檢測結果

假手術組的血管內(nèi)膜光滑、完整；而在球囊損傷并且給予30%Pluronic gel的對照組和轉染OPNSCR-siRNA對照組14 d，其內(nèi)彈力板消失，內(nèi)膜明顯增生。轉染OPN-siRNA-002與同一時間點對照組相比，內(nèi)膜增生受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。各組血管新生內(nèi)膜與中膜面積比見圖2和表2。

圖2 OPN-siRNA-002對球囊損傷后新生內(nèi)膜增生的影響

2.3 免疫組織化學染色結果

假手術組血管壁內(nèi)膜和中膜胞漿內(nèi)見微弱黃色顆粒，而血管球囊損傷后3、7及14 d，均出現(xiàn)棕黃色顆粒，主要分布于中膜及增厚的內(nèi)膜的細胞漿及細胞外基質中，MMP-14第3天最強，MMP-2第7天最強；OPN第14天最強。OPN-siRNA-002治療組在各個時間點的中膜和內(nèi)膜亦出現(xiàn)棕黃色顆粒，但較兩對照組明顯減輕（P＜0.01）。見圖3。

表2 血管球囊損傷后血管內(nèi)膜、中膜面積比（n=6，mm2±s）

表2 血管球囊損傷后血管內(nèi)膜、中膜面積比（n=6，mm2±s）

注：I為新生內(nèi)膜面積，M為中膜面積，I/M為內(nèi)膜面積與中膜面積比值。1）與假手術組比較，P＜0.01；2）與兩對照組比較，P＜0.01

組別指標術后7 d術后14 d假手術組新生內(nèi)膜面積00中膜面積0.131 5±0.012 70.132 5±0.012 7聚醚對照組新生內(nèi)膜面積0.098 5±0.006 01）0.132 7±0.015 21）中膜面積0.133 3±0.006 20.131 7±0.008 1 I/M0.740 5±0.030 01）1.009 0±0.116 51）OPN-SCR-siRNA對照組新生內(nèi)膜面積0.095 8±0.005 71）0.128 7±0.009 81）中膜面積0.129 0±0.005 70.132 0±0.005 9 I/M0.744 3±0.057 41）0.978 0±0.107 41）OPN-siRNA-002治療組新生內(nèi)膜面積0.041 0±0.004 82）0.065 2±0.009 92）中膜面積0.130 3±0.00420.125 0±0.015 5 I/M0.314 4±0.033 52）0.521 0±0.042 72）

圖3 OPN、MMP-2及MMP-14免疫組織化學染色結果（×400）

2.4 實時RT-PCR檢測

在假手術組，OPN、MMP-2、MMP-14 mRNA僅微弱表達；血管球囊損傷后，OPN、MMP-2、MMP-14 mRNA表達明顯升高；MMP-14 mRNA第3天達高峰，第14天時恢復正常水平；MMP-2 mRNA表達第7天達高峰，OPN mRNA表達第14天達高峰。經(jīng)OPN-siRNA治療后，同一時間點OPN、MMP-2、MMP-14 mRNA表達明顯減少（見圖4），與SCR-siRNA轉染及聚醚對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖4 實時RT-qPCR分析大鼠頸動脈損傷OPN、MMP-2 and MMP-14 mRNA表達（n=6）

圖5 Western blot分析大鼠頸動脈OPN、MMP-2與MMP-14蛋白表達水平，Actin作為內(nèi)參

2.5 Western blot檢測

在假手術組，OPN、MMP-2、MMP-14有微弱的蛋白條帶表達；然而，血管球囊損傷后3、7及14天后，OPN、MMP-2、MMP-14蛋白條帶灰度逐漸增加，MMP-14第3天最明顯，MMP-2第7天最明顯，OPN第14天最明顯。經(jīng)OPN siRNA治療后，同一時間點OPN、MMP-2、MMP-14表達明顯減少（見圖5），與OPN-SCR-siRNA轉染及聚醚對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）見表3。

表3 血管組織OPN、MMP-2、MMP-14蛋白表達（積分光密度比值，n=6±s）

表3 血管組織OPN、MMP-2、MMP-14蛋白表達（積分光密度比值，n=6±s）

注：1）與假手術組比較，P＜0.01；2）與兩對照組比較，P＜0.01

組別第3天第7天第14天OPN假手術組0.187 6±0.015 6 0.190 2±0.018 4 0.189 3±0.018 1聚醚對照組0.35 6±0.039 81）0.566 1±0.046 31）0.819 5±0.043 01）OPN-SCR-siRNA對照組0.359 2±0.029 11）0.550 1±0.046 61）0.804 4±0.050 71）OPN-siRNA-002治療組0.201 1±0.024 02）0.322 5±0.034 22）0.430 6±0.042 62）MMP-2假手術組0.165 7±0.015 8 0.166 2±0.016 1 0.164 8±0.015 0聚醚對照組0.359 4±0.033 31）0.584 3±0.070 31）0.501 1±0.052 81）OPN-SCR-siRNA對照組0.362 5±0.031 01）0.578 7±0.051 81）0.496 1±0.042 21）OPN-siRNA-002治療組0.192 1±0.018 52）0.329 2±0.026 92）0.303 0±0.026 92）MMP-14假手術組0.169 3±0.017 4 0.168 1±0.017 1 0.162 8±0.017 6聚醚對照組0.6176±0.08331）0.359 4±0.033 31）0.176 6±0.017 5 OPN-SCR-siRNA對照組0.612 0±0.055 11）0.362 5±0.031 01）0.178 1±0.019 2 OPN-siRNA-002治療組0.318 0±0.031 12）0.188 8±0.018 52）0.169 1±0.018 4

3 討論

EMC是血管損傷后新生內(nèi)膜的主要成分，在PTCA后發(fā)生RS的新生內(nèi)膜中，EMC的含量超過50%[10]，因此，EMC是血管再塑形的主要元素，也是形成RS的主要物質。研究發(fā)現(xiàn)，許多參與經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percataneous coronary intervention，PCI）術后RS的細胞因子都能夠刺激VSMC過度表達OPN[11-12]。應用抗OPN抗體可以抑制VSMC的表型轉化、遷移和增殖[13]。前期的研究也證明，使用針對大鼠OPN的反義核苷酸抑制OPN的表達后，可明顯抑制VSMC的增殖[14]，均表明以OPN為靶點在防治RS發(fā)生方面的重要作用。

鑒于siRNA轉染過程中容易受核酸的消化作用的影響，半衰期較短，研究人員對siRNA進行甲基化修飾，使其在細胞核內(nèi)長期穩(wěn)定存在。轉染途徑的選擇是決定siRNA效果的另一重要因素，血管壁基因轉移可經(jīng)血管腔內(nèi)和血管外膜兩種途經(jīng)。本研究受到WANG等[15]在血管外膜成功轉染siRNAADAMTS-7方法的啟示，探討血管損傷后，經(jīng)血管外膜轉染OPN-siRNA抑制血管內(nèi)膜增生的作用。為了證實經(jīng)血管外膜的轉染效果，本研究應用Cy3-SCR-siRNA，于損傷和轉染后第3天，取出局部血管并制成冰凍切片，可以發(fā)現(xiàn)，殘存血管外膜下、中膜及內(nèi)膜下均有紅色熒光分布，以中膜最為明顯，說明轉染效果滿意。實驗結果也表明，轉染后第7天，不僅OPN的mRNA和蛋白表達水平與對照組相比出現(xiàn)了明顯的下調，而且其內(nèi)膜增生的程度也被明顯地抑制，而且這種抑制作用一直持續(xù)到實驗結束的第14天。

NAGASE[16]認為MMP-2在細胞的遷移中起到關鍵作用，MMP-14、MMP-2酶原、TIMP-2在細胞表面形成三元絡合物，調節(jié)MMP-2的激活，降解ECM，促進細胞遷移。ECM，尤其是基底膜，是VSMC遷徙必需戰(zhàn)勝的生理屏障，其合成及降解失衡并沉積于動脈壁是AS、RS等病變加重的一個關鍵環(huán)節(jié)[17]。ECM合成及降解，以及平滑肌的遷移、增生都取決于MMPs和其組織抑制劑TIMPs之間的動態(tài)平衡[18]。MMPs由VSMC、巨噬細胞及其他一些細胞產(chǎn)生，是降解VSMC基底膜基質的主要酶類，導致血管VSMC由中膜向內(nèi)膜遷移并增生，進一步分泌大量ECM，從而促進內(nèi)膜增生、血管重構，最終導致RS的發(fā)生[19]。抑制MMPs活性可能降低RS的程度，其中尤以MMP-2最為重要，KUZUYA等[20]用MMP-2基因敲除小鼠進行實驗，在動脈損傷模型中發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增生程度比野生型小鼠明顯減輕，VSM遷移能力顯著下降。MMP-14是一類特殊的蛋白酶，研究認為其以無活性的MMP-2為作用底物，將其氮端剪切掉，成為中間活化狀態(tài)，進而轉變成完全活化的MMP-2，參與其酶原的激活反應；由于分布在細胞表面，人們認為其在細胞遷移中的作用更為重要[21-22]。

本研究表明，血管內(nèi)膜損傷后MMP-14和MMP-2表達增加，MMP-14在第3天達高峰，MMP-2在第7天達高峰，經(jīng)OPN-siRNA-002治療后表達相應減少。考慮可能OPN-siRNA-002阻斷下游細胞遷移相關基因MMP-14轉錄激活，從而也間接抑制了MMP-14激活MMP-2促進細胞遷移的作用。這與先前的一項體外研究應用OPN刺激VSMC的增生可以提高MMPs的活性一致[23]。而且另一項體外研究也顯示，OPN刺激MMP-2的激活是通過NF-κB介導的MMP-14的誘導產(chǎn)生，OPN誘導MMP-2生成在轉錄水平得到調控[24]。這些都支持OPN在血管再狹窄的發(fā)生中扮演著主角作用。

總之，此次研究成功地證明經(jīng)血管外膜轉染OPN-siRNA能夠顯著降低頸動脈損傷后OPN的表達，抑制細胞遷移的相關基因MMP-14及MMP-2的表達，減輕新生內(nèi)膜的形成。該研究為臨床治療RS提供一定實驗基礎及理論依據(jù)，進一步的研究還在進行中。

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（張蕾 編輯）

Effects of osteopontin-small interfering RNA on expressions of MMP-2 and MMP-14 after balloon injury of rat carotid artery*

Jian XU1,Feng FENG1,Gui-Nan LIU2
(1.Department of Cardiology,the First People's Hospital of Shenyang,Shenyang,Liaoning 110041,P.R.China;2.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital, China Medical University,Shenyang,Liaoning 110001,P.R.China)

【Objective】To investigate the effects of perivascular osteopontin-small interfering RNA(OPN-siRNA)transfer on neointima formation and MMP-2 and MMP-14 expressions after balloon injury of rat carotid artery and to explore the possible mechanism of inhibiting neointima formation.【Methods】The most sensitive OPN-siRNA-002 sequence was chosen by real-time RT-PCR in the previous experiment and used as transfection siRNA in the subsequent animal experiments,then perivascularly transfected with 30%pluronic gel.Six rats of each group were killed at different experimental endpoints after balloon injury.Hematoxylineosin(HE),immunohistochemistry,real-time RT-PCR and Western blot were used to evaluate neointima and the expressions of MMP-2 and MMP-14,and the role of OPN-siRNA on them was also studied.【Results】The neointimal thickness and mRNA and protein expressions of OPN,MMP-2 and MMP-14 were significantly decreased in the OPN-siRNA-002 group at each time point compared to those in the control group(P＜0.001).【Conclusion】OPN-siRNA-002 can inhibit intimal hyperplasia after artery injury by inhibiting the expressions of OPN,MMP-2 and MMP-14.

osteopontin；siRNA；restenosis；transfection；rat

R363；R-332

A

1005-8982（2015）30-0001-06

2015-01-29

沈陽市科技局立項項目（No：F13-220-9-32）