張欣，楊旭升，程國立，曹亞彬

（黑龍江省科學(xué)院生物肥料研究中心，哈爾濱150086）

苜蓿根瘤菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)工藝優(yōu)化

張欣，楊旭升，程國立，曹亞彬

（黑龍江省科學(xué)院生物肥料研究中心，哈爾濱150086）

本研究對傳統(tǒng)苜蓿根瘤菌發(fā)酵培養(yǎng)基——YMA培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，用較為廉價(jià)的麩皮替換其中的碳源甘露醇，并添加豆餅粉，以增加氮源，設(shè)置不同的添加比例與濃度，根據(jù)發(fā)酵過程中菌體數(shù)量的變化，篩選出較佳的培養(yǎng)基配方：麩皮0.5g+豆餅粉1.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+MgSO40.20g+NaCl0.10g+蒸餾水1 000mL。

苜蓿根瘤菌；發(fā)酵；培養(yǎng)基

生物固氮是指通過固氮微生物固氮酶系的催化將空氣中的分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化成氨態(tài)氮的過程，是地球上氮循環(huán)的一個(gè)重要組成部分。生物固氮將空氣中的氮?dú)庵苯愚D(zhuǎn)化為植物可利用的硝酸鹽或銨鹽，可為植物提供氮素，取材方便、成本低廉，還可降低因施用化肥引起的環(huán)境污染，提高土壤肥力［1-3］。近年來，豆科植物與根瘤菌共生固氮受到了專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。對豆科植物根瘤菌的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，不僅能夠降低成本、提高產(chǎn)量，同時(shí)可大大減少工業(yè)合成氮肥的施用量，減輕污染、改良土壤、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展［4-7］，因此具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益。

1　材料與方法

1.1供試菌株

苜蓿根瘤菌SM33，由黑龍江省科學(xué)院生物肥料研究中心保藏。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1YMA液體培養(yǎng)基

甘露醇10.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+ MgSO40.20g+NaCl0.10g+蒸餾水1 000mL，pH值為6.8～7.2。

1.2.2優(yōu)化培養(yǎng)基

將傳統(tǒng)YMA培養(yǎng)基中的碳源甘露醇替換為廉價(jià)麩皮，并添加氮源豆餅粉，設(shè)置二者不同比例、不同濃度。共設(shè)5個(gè)處理：麩皮0.25%+豆餅粉0.5%（處理1）、麩皮0.25%+豆餅粉1.0%（處理2）、麩皮0.5%+豆餅粉0.5%（處理3）、麩皮0.5%+豆餅粉1.0%（處理4）、麩皮1.0%+豆餅粉1.0%（處理5）。

1.3實(shí)驗(yàn)器材

本實(shí)驗(yàn)所用主要器材見表1。

表1　實(shí)驗(yàn)器材Tab.1 Experimental apparatus

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1菌株活化

將保藏的苜蓿根瘤菌菌株接種到Y(jié)MA固體培養(yǎng)基平板上，在電熱恒溫培養(yǎng)箱28℃條件下培養(yǎng)3d，挑選生長旺盛的菌落進(jìn)行再培養(yǎng)，純化分離出單一菌落［8］。

1.4.2種子液制備

把活化后的菌株，接種到Y(jié)MA培養(yǎng)基中，放入空氣浴振蕩器中，28℃條件下振蕩培養(yǎng)。按照平板計(jì)數(shù)法，測定培養(yǎng)液的活菌數(shù)量，使其達(dá)到2.0× 109/mL［8］。

1.4.3菌株發(fā)酵培養(yǎng)

分別配制YMA液體培養(yǎng)基及5種優(yōu)化培養(yǎng)基各500mL，分裝于5瓶500mL錐形瓶中，每瓶裝量100mL，向其中各接入2mL種子液，放入空氣浴振蕩器中，28℃、150rad/min條件下振蕩培養(yǎng)。

1.4.4菌株生長狀況測定方法

將各錐形瓶中的發(fā)酵液分別在不同時(shí)間段取樣，利用革蘭氏染色、常規(guī)染色法進(jìn)行苜蓿根瘤菌生長狀況檢測，血球計(jì)數(shù)法結(jié)合平板稀釋活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算苜蓿根瘤菌數(shù)量。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株在傳統(tǒng)YMA液體培養(yǎng)基中的生長狀況

將YMA液體培養(yǎng)基中的發(fā)酵液分別在培養(yǎng)后8h、12h、18h、24h、30h、36h、40h取樣，檢測菌體生長狀況并計(jì)算菌體數(shù)量（取平均值），結(jié)果見圖1：

圖1　苜蓿根瘤菌在YMA培養(yǎng)基中的生長Fig.1 The growth of Alfalfa Rhizobium in YMA medium

從圖1可以看出，培養(yǎng)時(shí)間在0～36h內(nèi)，苜蓿根瘤菌菌體數(shù)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，在培養(yǎng)至36h最多，達(dá)6.67×108/mL。當(dāng)培養(yǎng)至40h時(shí)，菌體衰亡，數(shù)量下降。

2.2菌株在優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長狀況

將5種優(yōu)化培養(yǎng)基中的發(fā)酵液分別在培養(yǎng)后8h、12h、18h、24h、30h、36h、40h取樣，檢測菌體生長狀況并計(jì)算菌體數(shù)量（取平均值），結(jié)果見圖2：

從圖2可以看出，將傳統(tǒng)YMA培養(yǎng)基中的碳源甘露醇替換為廉價(jià)麩皮，并添加氮源豆餅粉后，5個(gè)處理在各培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)菌體數(shù)量均有所增加，其中增量最大的是處理4，即麩皮0.5%+豆餅粉1.0%，在培養(yǎng)至36h時(shí)菌體數(shù)量最多，達(dá)17.45×108/mL。

圖2　苜蓿根瘤菌在不同培養(yǎng)基中的生長Fig.2 The growth of Alfalfa Rhizobia in different culture medium

3　結(jié)論

麩皮和豆餅粉價(jià)格低廉、取材方便且來源廣泛，而甘露醇等藥品的成本較高，不適合應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。本研究將傳統(tǒng)YMA培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，將其中的碳源甘露醇以廉價(jià)麩皮代替，并添加豆餅粉作為氮源，設(shè)置不同添加比例、添加濃度，根據(jù)發(fā)酵過程中苜蓿根瘤菌菌體數(shù)量的變化，得到較佳的培養(yǎng)基配方，即麩皮0.5g+豆餅粉1.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+ MgSO40.20g+NaCl0.10g+蒸餾水1 000mL，利用這一配方，生產(chǎn)出了活菌數(shù)達(dá)17億/mL以上的苜蓿根瘤菌菌劑，節(jié)約了生產(chǎn)成本并達(dá)到了促進(jìn)生長的目的，為實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化和大面積推廣應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

［1］陳文新，陳文峰.發(fā)揮生物固氮作用，減少化學(xué)氮肥用量［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2004，6（6）：3-5.

［2］郭春景.微生物肥料及其微生態(tài)效應(yīng)研究［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2004．

［3］Evans H J，Burns R H.1992.Highlights in biological nitrogen fixation during the last 50 years［C］//In：Stacey G Burris R H，Evans H J，eds.Biological Nitrogen Fixation.NewYork，London：Chapman&Hall，Inc.1．

［4］馬曉彤，劉惠琴，寧國贊.我國苜蓿根瘤菌與苜蓿共生固氮優(yōu)良組合研究進(jìn)展及前景［C］//第二屆中國苜蓿發(fā)展大會暨牧草種子、機(jī)械、產(chǎn)品展示會論文集，2003．

［5］寧國贊，劉惠琴.中國豆科牧草根瘤菌資源的采集保藏及利用［J］.草地學(xué)報(bào)，1999，7（2）：165-172．

［6］寧國贊，李元芳，劉惠琴.我國豆科牧草根瘤菌選育及應(yīng)用研究的進(jìn)展（1981～1988年）［J］.中國草地，1989，（03）：68-72．

［7］DILWORTH，M.1966.B.B.A.Distribution in soybean,common bean,and alfalfa［J］．J Plant Nutr,1998,21（3）：477-485．

［8］楊瓊博.pH值和化合態(tài)氮對紫花苜蓿結(jié)瘤和固氮效果的影響［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

Process Optimization of Alfalfa Rhizobium Strains Fermentation

ZHANGXin,YANGXu-sheng,CHENGGuo-li,CAOYa-bin
(Research Center ofBioFertilizer ofHeilongjiangAcademyofSciences,Harbin 150086,China)

This studyoptimized the traditional alfalfa rhizobia fermentation medium-YMA medium,replaced the carbon source ofmannitol with cheaper bran,and added bean cake powder,in order to increase the nitrogen source,set different adding proportion and concentration.According to the changes of the number of bacteria in the fermentation process,the better culture medium formula was selected:bran 0.5g+bean cake powder 1.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+MgSO40.20g+NaCl0.10g+distilled water 1000ml.

Alfalfa Rhizobia;Ferment;Culture medium

Q948

A

1674-8646（2015）09-0044-02

2015-07-01