王彩艷，田禎祥，劉承宜

(1.華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院和民族體質(zhì)與健康研究中心，激光運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣州510006;2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州510006;3.棗莊學(xué)院體育學(xué)院，棗莊277000)

壽命是衡量衰老過程的最確切指標(biāo)，黑腹果蠅(Drosophlia melanogaster)壽命只有3個(gè)月左右，適合用于壽命研究.壽命實(shí)驗(yàn)是通過統(tǒng)計(jì)生物的平均壽命(mean life span)和最高壽命(maximum life span)及其變化來(lái)衡量生命衰老規(guī)律和延緩衰老的方法［1］.Piazza 等［2］首次將黑腹果蠅引入運(yùn)動(dòng)生理學(xué)研究，證實(shí)了運(yùn)動(dòng)和飲食的抗衰老效應(yīng).低糖的膳食環(huán)境在女運(yùn)動(dòng)員中較多見，是引起女運(yùn)動(dòng)員三聯(lián)征的主要原因之一，避孕藥對(duì)運(yùn)動(dòng)成績(jī)的影響也存在爭(zhēng)議. 女運(yùn)動(dòng)員三聯(lián)征即飲食失調(diào)/不規(guī)律飲食習(xí)慣、閉經(jīng)/月經(jīng)過少、骨密度減低(骨質(zhì)疏松和骨量減少)，是女子運(yùn)動(dòng)中普遍存在的問題. Torstveit等［3］對(duì)精英運(yùn)動(dòng)員的調(diào)查顯示，優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員中有60.4%的人存在三聯(lián)征的風(fēng)險(xiǎn)，而在有美學(xué)特性的表演類項(xiàng)目中這種比例高達(dá)66.4%，球類運(yùn)動(dòng)員的這種風(fēng)險(xiǎn)為52.6%，一些體型偏瘦的運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目中比例達(dá)到70.1%，這些運(yùn)動(dòng)員應(yīng)力性骨折的發(fā)生率較高.而對(duì)于模式生物黑腹果蠅來(lái)講，對(duì)其壽命影響因素的研究可間接反映運(yùn)動(dòng)員身體狀況的改變，從而影響運(yùn)動(dòng)成績(jī)的發(fā)揮［2］.本文用雌性黑腹果蠅作為研究模型，通過探究黑腹果蠅壽命的影響因素——白砂糖和避孕藥質(zhì)量濃度，為女運(yùn)動(dòng)員的健康維護(hù)提供研究線索.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型黑腹果蠅Oregon R 品系由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶桑養(yǎng)殖中心提供.

1.1.2 試劑與儀器 高活性酵母，安琪酵母股份有限公司生產(chǎn);“佳一?！本咨疤?，廣東中輕糖業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn);麥胚芽和酵母粉，安徽“燕之坊”食品有限公司生產(chǎn);“媽富隆”(去氧孕烯炔雌醇片)短效口服避孕藥，荷蘭歐加農(nóng)制藥公司;丙酸，天津大茂化學(xué)試劑廠;無(wú)水乙醇，天津大茂化學(xué)試劑廠;上皿電子天平，型號(hào)FA2004，上海天平儀器廠;Eppendorf 移液槍，Germany 制造.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基 培養(yǎng)基Ⅰ:為基本培養(yǎng)基，用于果蠅的傳代培養(yǎng)，其主要成分:水100 mL，白砂糖5 g，瓊脂1 g，玉米粉5 g，麥胚芽5 g，酵母粉4 g，丙酸0.5 mL.將除丙酸外的各成分混合，攪拌均勻，煮沸，快要冷卻時(shí)加丙酸攪拌均勻，分裝到已滅菌的培養(yǎng)管中.

培養(yǎng)基Ⅱ:探究不同糖質(zhì)量濃度對(duì)果蠅壽命的影響所用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配比主要成分:水100 mL，瓊脂1.9 g，酵母粉3.2 g，丙酸0.87 mL，各組白砂糖質(zhì)量按表1 稱取，按培養(yǎng)基Ⅰ的方式煮培養(yǎng)基，其中4 號(hào)糖質(zhì)量濃度為基礎(chǔ)培養(yǎng)基［4］.

培養(yǎng)基Ⅲ:探究不同避孕藥質(zhì)量濃度對(duì)果蠅壽命的影響所用的培養(yǎng)基，根據(jù)糖質(zhì)量濃度影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，按照表1 選擇1 號(hào)(低糖)、3 號(hào)(正糖)、14號(hào)(高糖)下生長(zhǎng)的果蠅作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.去氧孕烯炔雌醇片是一種短效口服避孕藥，可長(zhǎng)期使用，其中每片含有去氧孕烯0.15 mg 與炔雌醇30 μg.按培養(yǎng)基Ⅰ的方式煮培養(yǎng)基Ⅱ中的1、3、14 號(hào)，冷卻加丙酸，攪拌均勻后按每100 mL 培養(yǎng)基加研磨充分的去氧孕烯炔雌醇片粉末分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60 mg，攪拌均勻后分裝到不同管，編號(hào)依次為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，代表培養(yǎng)基Ⅲ的不同組.

表1 培養(yǎng)基中糖的質(zhì)量Table 1 The mass of sugar in culture medium g

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 果蠅培養(yǎng)條件 果蠅置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件:氣溫(25 ±1)℃，相對(duì)濕度45% ～75%，12 L:12 D 條件下培養(yǎng).所用培養(yǎng)管105 ×27 mm2，玻璃厚1.5 mm.

1.2.2 白砂糖對(duì)雌果蠅壽命影響 收集在培養(yǎng)基Ⅰ生長(zhǎng)8 h 新羽化未交配的雌果蠅，隨機(jī)分管培養(yǎng)在培養(yǎng)基Ⅱ中，每組質(zhì)量濃度重復(fù)5 管，每管30 只雌果蠅.每5 天更換1 次培養(yǎng)基，每天統(tǒng)計(jì)果蠅存活數(shù)、死亡數(shù)，直到全部死亡，計(jì)算平均壽命、平均最高壽命(后5 只死亡的平均時(shí)間)、半數(shù)死亡的時(shí)間、死亡曲線如圖1. 分析結(jié)果選擇1 號(hào)作為低糖組、3 號(hào)作為正常糖組、14 號(hào)作為高糖組進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn).

1.2.3 去氧孕烯炔雌醇片對(duì)果蠅壽命影響 收集在培養(yǎng)基Ⅰ生長(zhǎng)8 h 內(nèi)新羽化未交配的雌果蠅，隨機(jī)分管培養(yǎng)在培養(yǎng)基Ⅲ中，每質(zhì)量濃度組重復(fù)5 管，每管30 只雌果蠅. 每5 d 更換1 次培養(yǎng)基，每天統(tǒng)計(jì)果蠅存活數(shù)、死亡數(shù)，直到全部死亡，計(jì)算平均壽命、平均最高壽命(后5 只死亡的平均時(shí)間)、半數(shù)死亡的時(shí)間、死亡曲線結(jié)果如圖2 ～5.

1.2. 4 統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析包處理，組間差異運(yùn)用One-way ANOVA 方法進(jìn)行分析，各組均數(shù)間差別比較采用LSD2 t檢驗(yàn)，顯著水平為P ＜0.05;極顯著水平為P ＜0.01.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同糖質(zhì)量濃度對(duì)雌果蠅壽命的影響

與0 組(無(wú)糖組)比較(圖1A)，糖質(zhì)量濃度1 ～8 組、10 組的平均壽命都有極顯著的延長(zhǎng)，12 組有顯著的延長(zhǎng)，其他高糖組(11 組、13 ～16 組)均無(wú)顯著性差異.平均最高壽命的結(jié)果顯示，與0 組相比，1 ～6 組都極顯著延長(zhǎng)，14 ～16 組極顯著縮短. 半數(shù)死亡時(shí)間結(jié)果顯示，與0 組相比，除11 組無(wú)顯著性的差異、13 號(hào)顯著性延長(zhǎng)外，其他各組都極顯著延長(zhǎng).如圖1B 所示，0 組果蠅的存活曲線位于坐標(biāo)軸最內(nèi)側(cè)，最高壽命為35 d;果蠅生長(zhǎng)15 d，0、11 ～16組的果蠅存活率開始急劇下降，而1 ～7 組在25 d才開始大量死亡.

圖1 糖對(duì)雌果蠅壽命(A)及存活率(B)的影響Figure 1 Effects of sugar on the longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

與3 號(hào)組(正糖)相比較，其他各組的雌果蠅平均壽命都有極顯著地縮短;各組的平均最高壽命(除1 號(hào)顯著降低外)均呈現(xiàn)極顯著降低;各組的半數(shù)死亡時(shí)間也都極顯著的降低(如圖1A).3 號(hào)組的存活曲線位于最外側(cè)，最高壽命是55 d 左右，較其他各組，3 號(hào)組的存活率狀態(tài)最好(如圖1B).

2.2 不同去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度對(duì)雌果蠅壽命的影響

2.2.1 去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度對(duì)低糖模型的影響 在1 號(hào)組糖質(zhì)量濃度(低糖)下，與0 號(hào)組(無(wú)藥組)相比(圖2A)，1 ～8 號(hào)的平均壽命都顯著性延長(zhǎng)，9 號(hào)和10 號(hào)差異不顯著. 各組平均最高壽命都與0 號(hào)組差異不顯著.1、5、6 號(hào)的半數(shù)死亡時(shí)間比0 號(hào)有顯著性延長(zhǎng)，其他組與0 號(hào)均無(wú)顯著性差異. 去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度并未對(duì)黑腹雌果蠅存活率產(chǎn)生顯著的影響(圖2B)，各質(zhì)量濃度組下的雌果蠅存活狀態(tài)變化不大，但去氧孕烯炔雌醇片能夠使雌果蠅的存活率略升高.

與5 號(hào)組相比，平均壽命除1 號(hào)和3 號(hào)無(wú)顯著性差異外，其他各組都顯著性縮短;與5 號(hào)給藥組的平均最高壽命相比，0、8、9、10 號(hào)組均有顯著性縮短;與5 號(hào)組的半數(shù)死亡時(shí)間相比，0、2、3、4 號(hào)有顯著性的縮短，8、9、10 號(hào)極顯著縮短(圖2A).

圖2 去氧孕烯炔雌醇片對(duì)低糖模型下果蠅壽命(A)及存活率(B)的影響Figure 2 Effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the low sugar-dependent longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

2.2.2 去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度對(duì)正常糖模型的影響 在3 號(hào)糖質(zhì)量濃度(正糖)模型下，1、4、5、7、9 號(hào)的平均壽命都比0 號(hào)組極顯著的延長(zhǎng)(圖3A)，6、8 號(hào)有顯著性的延長(zhǎng);各組的平均最高壽命與0 號(hào)組相比都有極顯著的延長(zhǎng);與0 號(hào)組的半數(shù)死亡時(shí)間相比，1 號(hào)和10 號(hào)有極顯著性縮短，2 號(hào)顯著縮短，而5 號(hào)有極顯著的延長(zhǎng).由圖3B 可知，3、5號(hào)的存活曲線在外圍，1、2、10 號(hào)的存活曲線在內(nèi)側(cè)，存活時(shí)間較短.

與5 號(hào)相比，各組的平均壽命都極顯著縮短;8、9 號(hào)平均最高壽命與5 號(hào)比較無(wú)顯著性變化，2號(hào)顯著性延長(zhǎng)，其他各組均極顯著縮短;其他各組的半數(shù)死亡時(shí)間均比5 號(hào)組有極顯著的縮短(如圖3A).

圖3 去氧孕烯炔雌醇片對(duì)正糖模型下果蠅壽命(A)及存活率(B)的影響Figure 3 Effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the normal sugar-dependent longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

2.2.3 去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度對(duì)高糖模型的影響 如圖4A 顯示，14 號(hào)糖(高糖)模型下，去氧孕烯炔雌醇片與果蠅平均壽命的關(guān)系圖呈現(xiàn)不是很規(guī)則的變化.對(duì)于平均壽命，與0 號(hào)相比，2、8、10 均有極顯著差異，1、6、7 號(hào)均有顯著性差異.平均最高壽命顯示出與平均壽命相似的趨勢(shì)，與0 號(hào)相比，1、2、6、8、10 號(hào)有顯著性的縮短. 半數(shù)死亡時(shí)間顯示，與0 號(hào)組相比，2、8 號(hào)有極顯著性差異，1、10 號(hào)有顯著性差異.如圖4B 顯示，0、4、5 號(hào)的存活曲線在外圍，靠?jī)?nèi)的則是2 號(hào)藥物質(zhì)量濃度.

與5 號(hào)組相比，2、8、10 號(hào)的平均壽命均極顯著縮短，4 號(hào)顯著上升;與5 號(hào)的平均最高壽命相比，1號(hào)和2 號(hào)有顯著性差異，8 號(hào)和10 號(hào)有極顯著性的縮短;只有2 號(hào)和8 號(hào)的半數(shù)死亡時(shí)間，與5 號(hào)組有極顯著性的差異(圖4A).

而與4 號(hào)組(本組壽命最高)相比，1、2、6、7、8、10 號(hào)的平均壽命都有極顯著性的降低，3、5 號(hào)有顯著性的降低;1、8、10 號(hào)的平均最高壽命則均有極顯著性降低，2、6 號(hào)則顯著性降低;2、8 號(hào)的半數(shù)死亡時(shí)間有極顯著性的縮短(如圖4A).

2.2.4 3個(gè)模型下，去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度對(duì)果蠅最長(zhǎng)壽命組影響的比較研究 如圖5A 顯示，與低糖(1 號(hào)糖模型下的5 號(hào)藥質(zhì)量濃度)比較，正糖(3 號(hào)糖模型下的5 號(hào)藥質(zhì)量濃度)的平均壽命、平均最高壽命、半數(shù)死亡時(shí)間都有顯著性的延長(zhǎng);高糖(14 號(hào)糖模型下的4 號(hào)藥質(zhì)量濃度)3個(gè)指標(biāo)都有極顯著的下降;正常無(wú)藥(3 號(hào)糖模型下的0 號(hào)藥質(zhì)量濃度)的平均壽命、半數(shù)死亡時(shí)間有顯著性的縮短，平均最高壽命有極顯著的縮短.圖5B 的存活率的結(jié)果顯示，與低糖模型的存活曲線相比，正常模型的存活曲線位于外圍，高糖模型的存活曲線位于內(nèi)側(cè)，正常無(wú)藥的存活曲線在35 天之前和低糖的很相似，但是35 天之后出現(xiàn)快速的縮短，最高壽命在40 天左右.

圖4 去氧孕烯炔雌醇片對(duì)高糖模型下果蠅壽命(A)及存活率(B)的影響Figure 4 Effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the high sugar-dependent longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

與正常模型比較，低糖模型下的平均壽命、平均最高壽命、半數(shù)死亡時(shí)間都有顯著性的縮短(圖5A);高糖模型3個(gè)指標(biāo)都有極顯著的縮短;正常糖質(zhì)量濃度下的無(wú)藥組的半數(shù)死亡時(shí)間有顯著性的縮短，平均壽命、平均最高壽命都有極顯著的縮短. 圖5B 的存活率的結(jié)果顯示，與正常模型的存活曲線相比，低糖模型和正常無(wú)藥交織位于內(nèi)側(cè)，高糖的位于最內(nèi)側(cè)，揭示存活率較低. 與高糖模型比較，正常無(wú)藥的各指標(biāo)都有極顯著的延長(zhǎng). 圖9B 的存活率的結(jié)果顯示，與高糖模型比較，正常無(wú)藥的存活曲線位于外側(cè)(圖5A).

3 討論

動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育離不開攝食，Jiang 等［5］在酵母、Lakowski 等［6］在線蟲、Chapman 等［7］在果蠅、Weindruchb 等［8］在嚙齒動(dòng)物乃至人類中已經(jīng)證實(shí)減少營(yíng)養(yǎng)的攝入可以延長(zhǎng)壽命［9］. 果蠅生活在培養(yǎng)管中，能量的來(lái)源只有培養(yǎng)基，因此研究培養(yǎng)各成分對(duì)果蠅壽命的影響對(duì)飲食限制具有實(shí)際意義. 糖是各種果蠅培養(yǎng)基不變的成分，研究發(fā)現(xiàn)果蠅能量限制的倒“U”型曲線［10］，這種曲線會(huì)隨著果蠅品系、食物來(lái)源、雌雄的差異等因素的變化而不同，本研究細(xì)化了糖質(zhì)量濃度，拉大了糖質(zhì)量濃度的范圍，發(fā)現(xiàn)在40.5 mg/mL 糖濃度(3 號(hào)組)下雌性黑腹果蠅的壽命顯著延長(zhǎng)，與3 號(hào)糖組相比，無(wú)糖(0 號(hào))組和高糖組(11 ～16 號(hào))壽命顯著降低，沒有能量與能量過剩都會(huì)導(dǎo)致壽命的縮短.1 號(hào)屬于低糖狀態(tài)，低糖狀態(tài)的雌性黑腹果蠅雖然沒有3 號(hào)正常糖下的黑腹果蠅壽命長(zhǎng)，但相對(duì)于高糖和無(wú)糖狀態(tài)的黑腹果蠅壽命是顯著性的延長(zhǎng)，這就提示適度降低糖元素的攝入對(duì)壽命的影響是有益的，同樣對(duì)于運(yùn)動(dòng)員也是成立的.但是長(zhǎng)期低糖膳食是引發(fā)女運(yùn)動(dòng)員三聯(lián)征的原因之一. 因此本文通過研究膳食和避孕藥兩者因素作用對(duì)雌性黑腹果蠅壽命的影響，使果蠅壽命狀態(tài)最佳，為解決女運(yùn)動(dòng)員三聯(lián)征問題提供線索.

圖5 去氧孕烯炔雌醇片對(duì)3 種條件下最長(zhǎng)壽命組果蠅壽命(A)及存活率(B)影響Figure 5 The effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the longevity (A)and the survival rate (B)of three kinds of female D. melanogaster

當(dāng)女性激素增多時(shí)，就會(huì)通過丘腦下部抑制或減少腦垂體分泌促性腺激素. 一旦促性腺激素被抑制或減少，卵巢里的卵泡就不會(huì)發(fā)育成熟和排卵.去氧孕烯炔雌醇片是一類短效口服避孕藥，通過去氧孕烯與炔雌醇抑制垂體－性腺軸來(lái)抑制排卵，另外還能增加宮頸粘液的粘稠度，達(dá)到避孕的效果.范光升等研究短效口服避孕藥是女性常用避孕藥，使生理周期達(dá)到一個(gè)新的周期，是有效而可逆的避孕方法之一［11］.避孕藥中含有雌激素，女性隨著年齡的增長(zhǎng)體內(nèi)雌激素水平會(huì)顯著下降，長(zhǎng)期服用避孕藥能起到調(diào)節(jié)體內(nèi)激素平衡的作用，對(duì)改善痛經(jīng)、痤瘡，光滑皮膚有幫助［12］. Philip C Hannaford 調(diào)查超過46 000 名英國(guó)女性分析了口服避孕藥使用情況與病死和暴力傷害致死之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在人生某些階段曾服用避孕藥的女性，因疾病死亡的風(fēng)險(xiǎn)較低［13］.但近幾年關(guān)于長(zhǎng)期口服避孕藥危害的研究也在同樣受到關(guān)注，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)糖脂代謝及血液學(xué)確實(shí)存在影響，但對(duì)免疫系統(tǒng)和遺傳基因影響不大，未有充分證據(jù)說明對(duì)腫瘤發(fā)生的促進(jìn)作用［14］.我們的研究發(fā)現(xiàn)在低糖模型下(13.5 mg/mL)，0.25 mg/mL 的避孕藥可以顯著地延長(zhǎng)果蠅壽命，而無(wú)避孕藥和高避孕藥質(zhì)量濃度都不利于雌性黑腹果蠅的生長(zhǎng);正常糖模型下(40.5 mg/mL)，避孕藥也是在0.25 mg/mL 質(zhì)量濃度下的雌性果蠅壽命狀況最好，顯著性相比低糖狀態(tài)更為明顯;然而在高糖模型下，雌性果蠅的壽命隨避孕藥質(zhì)量濃度變化不再出現(xiàn)明顯的倒U 型曲線，壽命最高點(diǎn)的質(zhì)量濃度出現(xiàn)在4號(hào)(0.20 mg/mL)，無(wú)避孕藥組的壽命較高，高質(zhì)量濃度組也未出現(xiàn)顯著性的下降. 提示運(yùn)動(dòng)員在服用避孕藥或激素類藥物的同時(shí)要注意飲食習(xí)慣的影響，低糖或者正常糖攝入會(huì)使避孕藥的作用發(fā)生顯著的變化.

4 結(jié)論

(1)在糖質(zhì)量濃度(40.5 mg/mL)(3 號(hào)組)下雌性黑腹果蠅的壽命顯著延長(zhǎng)，與3 號(hào)糖組(正糖)相比，無(wú)糖(0 號(hào))組和高糖組(11 ～16 號(hào))壽命顯著降低，沒有能量與能量過剩都會(huì)導(dǎo)致壽命的縮短.

(2)由不同糖模型狀態(tài)下避孕藥對(duì)雌性黑腹果蠅壽命影響的結(jié)果提示運(yùn)動(dòng)員在服用避孕藥或激素類藥物的同時(shí)要注意飲食習(xí)慣的影響，低糖或者正常糖攝入會(huì)使避孕藥的作用發(fā)生顯著的變化.

［1］劉貴珊，張澤生. 白藜蘆醇對(duì)果蠅壽命和抗氧化能力的影響［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34(9):19－21.Liu G S，Zhang Z S. Effect of resveratrol on life-span and antioxidation in Drosophila Melanogaster［J］. Food Research and Development，2013，34(9):19－21.

［2］Plazza N，Gosangi B，Devilla S，et al. Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance［J］. Public Library of Science，2009，4(6):e5886－e5886.

［3］Torstveit M K，Sundgot-borgen J. The female athlete triad:are elite athletes at increased risk?［J］. Medical ＆Science in Sports ＆ Exercise，2005，37(2):184－193.

［4］Luckinbill L S，Arking R，Clare M，et al. Selection for delayed senescence in Drosophila melanogaster［J］. Evolution，1984，38(5):996－1003.

［5］Jiang J C，Jaruga E，Repnevskaya M V，et al.An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast［J］. The FASEB Journal，2000，14(14):2135－2137.

［6］Lakowsli B，Hekimi S.The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，1998，95(22):13091－13096.

［7］Chapman T，Partridge L. Female fitness in Drosophila melanogaster:An interaction between the effect of nutrition and of encounter rate with males［J］. Proceedings of the Royal Society B:Biological Sciences，1996，263(1371):755－759.

［8］Weindruchb R，Walford L，F(xiàn)ligiel S，et al.The retardation of aging in mice by dietary restriction:Longevity，cancer，immunity and lifetime energy intake［J］. Nutrition，1986，116(4):641－654.

［9］Heilbronn L K，Jonge L，F(xiàn)risard M I，et al.Effect of 6-month calorie restriction on biomarkers of longevity，metabolic adaptation，and oxidative stress in overweight individuals:A randomized controlled trial［J］. Journal of the American Medical Association，2006，295(13):1539－1548.

［10］Clancy D J，Gems D，Hafen E，et al.Dietary restriction in long-lived dwarf flies［J］.Science，2002，296(5566):319－319.

［11］范光升.避孕藥物的研究進(jìn)展——常用女用避孕藥的種類與選擇［J］. 中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2005，21(1):5－6.Fan G L. Research progress of contraceptives［J］. Chinese Journal of Practical Gynecology and Obstetrics，2005，21(1):5－6.

［12］戴曉君.達(dá)英－35 聯(lián)合二甲雙胍治療多囊卵巢綜合征的療效［J］. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(10):1663－1665.

［13］Hannaford P C，Iversen L，Macfarlane T V，et al.Mortality among contraceptive pill users:Cohort evidence from Royal College of General Practitioners［J］. British Medical Journal，2010，340(340):c927－c927.

［14］嚴(yán)振民，任曉文.長(zhǎng)期使用口服避孕藥副作用的研究概況［J］.天津藥學(xué)，1994，6(2):25－28.