尹思泳 陳鐘揚 梁華倫 黎 奔

廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120

何首烏為常用中藥材，在醫(yī)療和保健中使用廣泛，具有補肝腎，益精血，烏須發(fā)，強筋骨，化濁降脂功效，是中醫(yī)補肝腎的主要藥物之一［1］。2014年7月，國家食品藥品監(jiān)督管理局通過中央電視臺等新聞媒體發(fā)布國家藥品不良反應(yīng)病例報告數(shù)據(jù)庫陸續(xù)收到口服何首烏及其成方制劑導(dǎo)致肝損傷的病例報告，經(jīng)對相關(guān)病例進行分析并結(jié)合有關(guān)文獻報道綜合評價，認為口服何首烏及其成方制劑與肝損傷發(fā)生有一定相關(guān)性，指出口服何首烏及其成方制劑引起的肝損傷多呈可逆性，停藥或?qū)ΠY治療后，預(yù)后多較好。但是，超劑量、長期連續(xù)用藥等可能增加其風(fēng)險［2］。乙肝寧顆粒屬于國家中藥保護品種，由黃芪、丹參、何首烏、茵陳、川楝子等13 味中藥組成，具有補氣健脾、活血化瘀、清熱解毒等功效，臨床用于治療急慢性肝炎［3］。方中何首烏的主要有效成分是二苯乙烯苷和結(jié)合蒽醌［1］，然而藥典質(zhì)量標準中含量測定項僅有黃芪的黃芪甲苷和白芍的芍藥苷［1］，而無何首烏的有效成分二苯乙烯苷含量的測定。目前，有不少文獻報道了對其他成分含量分析的報道［3～4］，但很少有對何首烏有效成分測定的報道。為此，本研究采用HPLC 法測定乙肝寧顆粒中二苯乙烯苷的含量，對保證其臨床用藥安全，減少或杜絕藥源性肝病具有積極的意義，同時為該藥的全面質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器和試藥

實驗儀器:美國安捷倫1200 液相色譜儀(帶DAD 檢測器和自動進樣器);試藥:乙肝寧顆粒 (201401571，201401581 和201401591 三批，湖南某藥業(yè)股份有限公司，購自老百姓大藥房);二苯乙烯苷對照品(批號為110844-200908，購自中檢所);甲醇購自默克公司，色譜純，其他試劑為分析純，去離子水為實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 提取方法的選擇 超聲法:取乙肝寧顆粒(批號201401571)適量，約10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50% 乙醇50ml，稱定重量，超聲處理 (功率120W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，濾過，作為供試品溶液。

回流法:取供試品(批號201401571)，按超聲法操作，將“超聲30min”改為“回流30min”，其余同超聲法制備。

分別取上述兩種溶液10μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果如下(見表1)。

表1 不同提取方法的試驗結(jié)果 (n=3)

從表1 可以看出，采用超聲法測定結(jié)果高于回流法。

2.1.2 提取溶劑的選擇 為了獲得最優(yōu)提取溶劑，本實驗根據(jù)二苯乙烯苷的溶解特性，分別采用水、稀乙醇(50.0%)以及甲醇作為溶劑進行提取。取乙肝寧顆粒(批號201401571)，照2.1.1 法中超聲法，分別用水、稀乙醇(50.0%)、甲醇進行提取制備供試品溶液，分別測定樣品中二苯乙烯苷的含量。結(jié)果見表2。

表2 不同溶劑試驗結(jié)果 (n=3)

從表2 可以看出稀乙醇的提取效率高于甲醇、水。這可能是由于乙肝寧顆粒在水溶液的環(huán)境中溶化性較好，在溶解于水中后，二苯乙烯苷再分散于稀乙醇所致。

2.1.3 提取時間的選擇 為了獲得最優(yōu)提取時間，取乙肝寧顆粒(批號201401571)3 份，以甲醇為提取溶劑，按超聲法，分別超聲處理15min，30min，60min，制成供試品溶液，分別測定二苯乙烯苷的含量。結(jié)果見表3。

表3 提取時間對二苯乙烯苷含量的影響 (n=3)

從表3 可以看出，隨著超聲時間的延長，樣品溶液中的二苯乙烯苷濃度增加，到30min 左右達到峰值，隨后基本穩(wěn)定?？赡茉蚴浅?5min 時樣品中二苯乙烯苷提取不完全，在超聲30min 到達峰值后已經(jīng)提取完全。因此選擇30min 作為本品提取時間。

綜上，乙肝寧顆粒中二苯乙烯苷的最佳提取方法為:取本品約10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)30min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，濾過，即得。

2.2 對照品溶液的制備 取經(jīng)二苯乙烯苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml 約含5mg 的溶液，其他濃度的對照溶液采用稀釋法稀釋制備，各濃度對照溶液冷藏，備用，整個過程避光操作。

2.3 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水(25∶75)為流動相，檢測波長為320nm，流速為1.0ml/min，柱溫35℃，進樣量10μl，以外標標準曲線法定量。

2.4 方法專屬性 精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10μl，注入HPLC，記錄色譜圖，由色譜圖提示，在對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，空白溶劑(流動相)在此峰位置無吸收，對本品中二苯乙烯苷含量測定沒有干擾，方法專屬性良好。

2.5 標準曲線的繪制 精密量取濃度約為5mg/ml 的二苯乙烯苷對照品溶液1000、200、20 和10μl 至10ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列梯度溶液。分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，按含量測定方法測定，記錄色譜圖。以對照品的濃度(mg/ml)為橫坐標(x)，測得的峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線。得回歸方程:y=268.7x-16.86，r=1。結(jié)果表明，二苯乙烯苷對照品濃度在0.005～5mg/ml 之間與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密吸取濃度為0.1mg/ml 的二苯乙烯苷對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，重復(fù)連續(xù)進樣6 次，測定二苯乙烯苷峰面積，此時，二苯乙烯苷峰面積的RSD=0.12%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一二苯乙烯苷對照品溶液，分別在0、8、16 和24h 按上述色譜條件注入液相色譜儀，測定二苯乙烯苷峰面積，此時二苯乙烯苷峰面積的RSD=0.68%，表明二苯乙烯苷對照品溶液在此條件下穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性 取同一批供試品(批號201401571)6 份，參照上述提取方法，按含量測定方法測定，記錄峰面積，計算含量，測得該批號乙肝寧顆粒中二苯乙烯苷的含量為0.056mg/g，RSD=0.93% (n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率測定 取同一批已知含量(批號201401571)的供試品6 份，按照樣品含量的100%將二苯乙烯苷對照品溶液加入到樣品中，依上述最優(yōu)提取條件進行提取，制備回收溶液，注入高效液相色譜儀，每份重復(fù)進樣2 次，共12 次，記錄色譜圖，計算回收率。結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗結(jié)果 (n=2)

2.10 樣品測定 實測樣品3個，每個2 份，共計6 份，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，用標準曲線法計算二苯乙烯苷含量。結(jié)果見表5

表5 樣品測試結(jié)果表

5 討論

乙肝寧顆粒屬于國家中藥保護品種，也是補氣健脾、活血化瘀、清熱解毒的常用藥物之一，在《中國藥典》2010 版未對其主要成分何首烏進行質(zhì)量控制。筆者為建立何首烏中有效成分二苯乙烯苷的含量測定方法，在試驗過程中對提取方法、提取溶液、提取時間三個因素進行了考查，最終確定提取條件為采用稀乙醇(50%)為提取劑，用超聲萃取的方法提取乙肝寧顆粒中的二苯乙烯苷。建立了高效液相色譜法測定乙肝寧顆粒中二苯乙烯苷的含量的方法，結(jié)果表明二苯乙烯苷含量為0.005～5 mg/ml 之間呈良好的線性關(guān)系，專屬性強，回收率在96.79%～101.08%之間，且操作簡便、準確，重現(xiàn)性好，靈敏度高，陰性對照發(fā)現(xiàn)無干擾。本實驗為乙肝寧顆粒進一步的質(zhì)量標準控制提供了技術(shù)支持。

［1］國家藥典委員會.中國藥典(一部) ［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:164.

［2］國家食品藥品監(jiān)督管理局.藥品不良反應(yīng)信息通報［B/OL］http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0051/102902.html，2014-7-26.

［3］張秋蓉，周濃，楊敏.HPLC 測定乙肝寧顆粒中川楝素［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16 (10):78-79.

［4］梁國華，羅秀偉.高效液相色譜法測定乙肝寧顆粒中芍藥苷含量［J］.中國藥業(yè)，2008，17 (1):29-30.