蔣云山，黃河，黃向紅，李輝，范雙喜，李輝瑩，盧永娟，譚小軍

（湖南省湘潭市中心醫(yī)院，湖南 湘潭 411100）

一遺傳性心臟傳導(dǎo)阻滯疾病家系的基因突變篩查*

蔣云山，黃河，黃向紅，李輝，范雙喜，李輝瑩，盧永娟，譚小軍

（湖南省湘潭市中心醫(yī)院，湖南 湘潭 411100）

目的對(duì)一個(gè)常染色體顯性遺傳性心臟傳導(dǎo)阻滯疾?。–CD）家系進(jìn)行已知致病基因的篩查。方法以該家系為研究對(duì)象，獲取相關(guān)臨床資料，提取外周血基因組DNA。選擇3個(gè)已知與遺傳性CCD相關(guān)的候選基因：心臟特異性同源盒基因（NKX2.5）、心臟鈉離子通道α亞單位基因（SCN5A）和核纖層蛋白基因（LMNA），對(duì)5例患者進(jìn)行基因直接測(cè)序篩查。針對(duì)發(fā)現(xiàn)有突變的外顯子，對(duì)其余成員的DNA樣本同樣進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增和序列分析。結(jié)果遺傳性CCD家系的遺傳方式為常染色體顯性遺傳，臨床表現(xiàn)符合遺傳性CCD。對(duì)家系中患者及其他成員進(jìn)行相關(guān)致病基因的所有外顯子及其剪切位點(diǎn)區(qū)域的直接測(cè)序分析，未發(fā)現(xiàn)能引起編碼氨基酸改變的堿基突變。結(jié)論遺傳性CCD家系診斷為L(zhǎng)enègre-Lev病。初步的分子遺傳學(xué)篩查未檢測(cè)到該家系中存在NKX2.5、SCN5A和LMNA基因的有意義突變，提示可能存在其他致病基因參與CCD的發(fā)生，有待進(jìn)一步研究。

常染色體顯性遺傳；進(jìn)行性心臟傳導(dǎo)阻滯；Lenègre-Lev??；基因突變；家系

心臟傳導(dǎo)阻滯（cardiac conduction defect，CCD）是一類嚴(yán)重的潛在威脅生命的疾病[1]。其中最常見(jiàn)的是特發(fā)性雙邊束支纖維化?。ㄓ址QLenègre-Lev?。?。目前研究證實(shí)，基因突變是遺傳性CCD的常見(jiàn)病因，其中心臟特異性同源盒基因（cardiac-specific homeobo，NKX2.5）、心臟鈉離子通道α亞單位基因（voltage-gated sodium channeltypeⅤ，SCN5A）和核纖層蛋白基因（lamin A/C，LMNA）突變與遺傳性CCD的相關(guān)性得到多篇文獻(xiàn)的論證。

本課題組收集到1個(gè)5代共68例的常染色體顯性遺傳性CCD家系成員，前期研究結(jié)果發(fā)表在2009年第6期的《中國(guó)心臟起搏與心電生理雜志》。該家系診斷為L(zhǎng)enègre-Lev病，但心電圖特征提示Lenègre-Lev病可能存在第3型，即最初發(fā)病部位在心房?jī)?nèi)傳導(dǎo)系統(tǒng)，以后病變逐步沿心臟特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)向His束發(fā)展，并演變?yōu)棰蠖确渴覀鲗?dǎo)阻滯（atrial ventricular block，AVB）。該家系特殊的起病方式是否與上述已知基因突變或其他基因相關(guān)尚不清楚。本課題組通過(guò)直接測(cè)序方法對(duì)已知的CCD相關(guān)候選基因進(jìn)行突變篩查，以期找到致病基因，有利于研究發(fā)病機(jī)制，篩選出家系中的潛在患者，提醒其采取防范措施，避免猝死發(fā)生，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

筆者收集到湘潭市的1個(gè)CCD家系，該家系有5代共68例家系成員。其中7例為CCD患者（現(xiàn)存4代60例，5例患者）。先證者（Ⅲ19）為57歲男性，37歲時(shí)因心悸短暫暈厥就診，心電圖（electrocardiogram，ECG）檢查為Ⅰ度AVB，超聲心動(dòng)圖（ultrasound cardiogram，UCG）檢查提示心臟4個(gè)腔室大小正常；41歲時(shí)進(jìn)展為Ⅲ度AVB和房顫，UCG檢查提示心臟擴(kuò)大，47歲時(shí)行右心室按需型起搏器植入術(shù)。對(duì)該家系中患者及其親屬共22例成員進(jìn)行病史詢問(wèn)、心肺檢查、ECG檢查，并抽取外周靜脈血5～10ml用于基因組DNA的提取。本實(shí)驗(yàn)由湘潭市中心醫(yī)院生殖中心及心內(nèi)科共同完成，對(duì)該家系的分子遺傳學(xué)研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的論證。

應(yīng)用Cyrillic 3.0軟件繪制圖譜。通過(guò)系譜圖分析得知，該CCD家系表現(xiàn)為4代連續(xù)遺傳（其中Ⅰ1突然猝死，原因不詳，疑為CCD患者，第5代因年齡小，未見(jiàn)發(fā)病）；男女發(fā)病幾率相同，而且患者后代有50%左右的發(fā)病率；家系中已經(jīng)明確診斷的患者有7例，其中男性5例，女性2例。Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ7在50～75歲猝死，死因不詳。見(jiàn)圖1。

圖1 Lenègre-Lev病系譜圖

1.2臨床心電圖檢查

根據(jù)《新編臨床醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)手冊(cè)》對(duì)家系內(nèi)成員進(jìn)行心肺檢查，檢查內(nèi)容包括體表心電圖。完全性右束支阻滯（right bundle branch block，RBBB）3例（其中1例演變?yōu)棰穸華VB），Ⅰ度AVB 2例（其中1例演變?yōu)棰蠖華VB），Ⅱ度AVB 2例，Ⅲ度AVB 2例，Ⅱ度竇房傳導(dǎo)阻滯（sinoatrial block，SAB）2例，均表現(xiàn)為CCD。其中，先證者Ⅲ19的心電圖檢查由完全性RBBB演變?yōu)棰蠖華VB伴有RBBB和Ⅱ度SAB。接受檢查的家系成員心電圖檢查結(jié)果見(jiàn)表1。

先證者（Ⅲ19）ECG檢查提示Ⅲ度AVB、竇性心動(dòng)過(guò)緩、交界性逸搏心率（見(jiàn)圖2A）。先證者堂兄（Ⅲ5）2001年ECG提示完全性RBBB、竇性心動(dòng)過(guò)緩、Ⅰ度AVB，UCG及核素心肌掃描正常，臨床診斷為原發(fā)性傳導(dǎo)束退化癥；2007年ECG提示Ⅲ度AVB、完全性RBBB、Ⅱ度SAB，冠狀動(dòng)脈造影正常，UCG檢查雙心房擴(kuò)大（見(jiàn)圖2B）。先證者堂姐妹（Ⅲ31）ECG提示竇性心動(dòng)過(guò)緩和完全性RBBB。先證者侄子（Ⅳ14）ECG提示竇性心動(dòng)過(guò)緩、Ⅱ度AVB、ST-T改變、房性早搏未下傳。先證者之子（Ⅳ21）ECG提示Ⅱ度Ⅰ型房室傳導(dǎo)阻滯。

圖2 ECG檢查

1.3研究方法

1.3.1樣本采集及DNA的提取按照血液基因組DNA提取試劑盒（Qiagen）說(shuō)明書(shū)抽提外周血白細(xì)胞的基因組DNA。取適量DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量和純度檢測(cè)，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2候選基因的選擇和引物設(shè)計(jì)參考美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心基因數(shù)據(jù)庫(kù)的基因組和mRNA序列信息，結(jié)合已發(fā)表的文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)覆蓋已知的CCD發(fā)生相關(guān)基因SCN5A、NKX2.5和LMNA的全部外顯子及其剪切位點(diǎn)區(qū)域的引物，其中SCN5A有2個(gè)外顯子，NKX2.5有28個(gè)外顯子，LMNA有12個(gè)外顯子，引物序列見(jiàn)表2。所有引物由上海生物工程股份有限公司合成。

表1 Lenègre-Lev病家系成員的臨床檢查結(jié)果

1.3.3聚合酶鏈反應(yīng)以基因組DNA為模板，采用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法擴(kuò)增目的DNA片段。本研究采用的PCR反應(yīng)體系為50μl，其中包括100μg基因組DNA，10 mol/L引物，200 mmol/L dNTP和Tag酶。PCR反應(yīng)在DNA熱循環(huán)儀（美國(guó)Bio-rad公司）上進(jìn)行，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性10 s，65℃退火30 s，68℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)。取5μl PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，100 bp DNA Marker鑒定擴(kuò)增片段。

續(xù)表1

表23 個(gè)候選基因的PCR和測(cè)序引物

續(xù)表2

1.3.4測(cè)序分析PCR產(chǎn)物送深圳華大生物技術(shù)有限公司純化后直接測(cè)序（ABI377自動(dòng)DNA測(cè)序儀）。測(cè)序引物與PCR引物相同。參考已報(bào)道的致病基因突變位點(diǎn)和美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心提供的候選基因SCN5A、NKX2.5和LMNA的標(biāo)準(zhǔn)基因序列，應(yīng)用DNAman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析比對(duì)，判斷是否存在突變位點(diǎn)及氨基酸序列的變化。若發(fā)現(xiàn)可疑突變，重新稀釋DNA模板，對(duì)基因外顯子進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)和反向測(cè)序予以驗(yàn)證。

2 結(jié)果

選取Ⅲ5、Ⅲ7、Ⅲ19、Ⅳ14及Ⅳ21共5例患者進(jìn)行LMNA和SCN5A、NKX2.5基因全部外顯子和部分剪切位點(diǎn)區(qū)域DNA片段的PCR擴(kuò)增，凝膠電泳分析可見(jiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。PCR擴(kuò)增片段產(chǎn)物純化后經(jīng)直接測(cè)序分析，未發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道的候選基因一致的突變位點(diǎn)。

3 討論

本課題組黃河等[2]證實(shí)遺傳性CCD家系疾病被診斷為L(zhǎng)enègre-Lev病。Lenègre-Lev病是以心房和心室內(nèi)傳導(dǎo)系統(tǒng)異常為特征的一種疾病；主要特點(diǎn)為希浦系的心臟內(nèi)傳導(dǎo)系統(tǒng)出現(xiàn)進(jìn)行性傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致房室或室內(nèi)傳導(dǎo)阻滯；病因不明，該病具有一定的異質(zhì)性，病情嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致暈厥或猝死[1，3]。因此，篩查致病基因?qū)υ摷蚁导膊〉姆肿訖C(jī)制研究及預(yù)防猝死極為重要。

CCD是一種多重病因的遺傳異質(zhì)性疾病，其中遺傳學(xué)因素在CCD發(fā)病中的作用日益受到重視。該病一般以常染色體顯性的方式遺傳[4]。該家系患者雙親之一為CCD患者或疑似患者，男女均可發(fā)病，有連續(xù)傳代的特點(diǎn)，符合常染色體顯性遺傳病的特征，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多種基因異常與CCD有關(guān)，其中較多的是3個(gè)主要候選基因SCN5A、NKX2.5和LMNA突變能夠引發(fā)進(jìn)行性CCD的證據(jù)。

3.1SCN5A基因

SCN5A基因位于染色體3p21，編碼心肌細(xì)胞膜上的鈉離子電壓門(mén)控通道Nav1.5。其突變后可引起Navl.5結(jié)構(gòu)異常，造成快鈉通道功能障礙，快反應(yīng)細(xì)胞動(dòng)作電位0期鈉離子內(nèi)流減少，去極化速率以及幅值減小，從而降低傳導(dǎo)速度，引起傳導(dǎo)阻滯。SCN5A基因突變后可引起病態(tài)竇房結(jié)綜合征（sick sinus syndrome，SSS）[5]、進(jìn)行性以及非進(jìn)行性CCD[6-9]等多種心臟傳導(dǎo)疾病。周熙惠等[10]發(fā)現(xiàn)1個(gè)CCD家系SCN5A基因新突變L1001Q。功能研究顯示，該突變主要通過(guò)改變鈉通道門(mén)控特性，引起鈉通道功能減弱，導(dǎo)致CCD。鄧堯等[11]通過(guò)全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)一心臟傳導(dǎo)疾病家系的SCN5A新的雜合突變P. Y1495X。此外，國(guó)外多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SCN5A多個(gè)位點(diǎn)的錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、移碼突變等可導(dǎo)致CCD。

3.2NKX2.5基因

人類CSX/NKX2.5基因定位于染色體5q34和5q35，有972 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼含324個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。人類CSX/NKX2.5蛋白同源結(jié)構(gòu)域HD含有高度保守的60個(gè)氨基酸殘基，是與DNA結(jié)合的必需結(jié)構(gòu)。NKX2.5基因是心臟發(fā)育過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，是所有脊椎動(dòng)物心臟發(fā)生中最早表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一，參與心臟前體細(xì)胞的分化、心臟環(huán)化、房室分隔、房室流出道和傳導(dǎo)系統(tǒng)的形成[12]。多篇文章報(bào)道NKX2.5基因的突變可導(dǎo)致CCD[13-16]。

3.3LMNA基因

LMNA基因位于染色體1q21.2～q21.3，基因組序列全長(zhǎng)56.7 kb其中編碼區(qū)域約24 kb，包含l2個(gè)外顯子[17]。LMNA基因編碼蛋白產(chǎn)物為L(zhǎng)amin A和C，是組成細(xì)胞核纖層的重要成分，在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)形態(tài)學(xué)的發(fā)生、發(fā)育和功能維持方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，突變可導(dǎo)致多種遺傳性疾病，包括CCD[18-21]。

本課題組通過(guò)直接測(cè)序法對(duì)家系患者的SCN5A、NKX2.5和LMNA基因的全部外顯子和部分剪接區(qū)域進(jìn)行突變篩查。結(jié)果既未發(fā)現(xiàn)已知的致病突變，也未檢測(cè)到新的致病位點(diǎn)，提示本家系CCD發(fā)病機(jī)制可能與其他基因突變有關(guān)。本課題組下一步將針對(duì)家系中的關(guān)鍵患者及正常人開(kāi)展全外顯子組掃描分析，判斷是否與已知基因存在連鎖，結(jié)合外顯子組測(cè)序和生物信息學(xué)分析繼續(xù)對(duì)該家系的致病性突變位點(diǎn)定位和驗(yàn)證，并對(duì)新的致病基因功能進(jìn)行觀察和分析，為遺傳學(xué)檢查、產(chǎn)前診斷、新生兒篩查及疾病治療等提供依據(jù)，為闡明CCD的分子遺傳學(xué)機(jī)制提供新的線索。

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（童穎丹 編輯）

Gene mutation screening in a Chinese pedigree with genetic cardiac conduction block*

Yun-shan JIANG,He HUANG,Xiang-hong HUANG,Hui LI,Shuang-xi FAN, Hui-ying LI,Yong-juan LYU,Xiao-jun Tan
(Xiangtan Central Hospital,Xiangtan,Hunan 411100,P.R.China)

【Objective】To screen the known causative gene mutations in a Chinese pedigree suffered from autosomal dominant cardiac conduction block disease.【Methods】A Chinese pedigree with genetic cardiac conduction block was collected as the research subjects.ECGs of the family members were analyzed, their peripheral venous blood was collected and genomic DNA was extracted.Three known candidate genes [cardiac-specific homeobox 1(NKX2.5),voltage-gated sodium channel typeⅤ(SCN5A)and lamin A/C(LMNA)]associated with genetic cardiac conduction block were screened in 5 patients by direct gene sequencing. The mutant exons discovered were then screened in the remaining members using PCR and gene sequencing.【Results】The inheritance mode of the family was autosomal dominant.Clinical manifestations of the patients conformed to genetic heart block.Direct gene sequencing analysis of the 3 genes in the patients of this pedigree did not reveal the causative gene mutations.【Conclusions】This pedigree has been diagnosed as Lenègre-Lev disease.The causative gene mutations have not been found in screening of NKX2.5,SCN5A and LMNA gene mutations,suggesting the presence of other causative genes in this genetic cardiac conduction disease,which needs further study.

autosomal dominant inheritance;progressive cardiac conduction block;Lenègre-Lev disease; gene mutation;pedigree

R541.76；R394

B

1005-8982（2015）32-0063-07

2015-04-27

湘潭市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（No：ZD20121017）

譚小軍，E-mail：changdaot@163.com；Tel：18607321777