邢秀月

（海南省瓊海市人民醫(yī)院婦產科，海南 瓊海 571400）

·臨床論著·

CD73在宮頸癌中的表達及臨床意義

邢秀月

（海南省瓊海市人民醫(yī)院婦產科，海南 瓊海 571400）

目的探討CD73在宮頸癌組織中的表達及臨床價值。方法采用免疫組織化學法檢測74例宮頸癌組織、49例宮頸上皮內瘤變（CIN）組織和74例正常宮頸上皮組織中CD73蛋白的表達，并分析其與宮頸癌患者臨床病理參數的相關性。采用Western blot隨機檢測4例宮頸癌組織及自身對應正常宮頸上皮組織中CD73蛋白的表達。結果宮頸癌組織中CD73蛋白表達的陽性率顯著高于CIN組織和正常宮頸上皮組織（P＜0.05）。CD73蛋白表達與宮頸癌患者年齡、組織學分化無關（P＞0.05），但與臨床分期、浸潤深度和淋巴結轉移密切相關（P＜0.05）。Western blot檢測表明，宮頸癌組織中CD73蛋白的表達顯著高于正常宮頸上皮組織（P＜0.05）。結論CD73有望成為評價宮頸癌惡性程度和預后的指標。

CD73；宮頸癌；預后

1934年5-核苷酸酶（5’-nucleotidase，5’-NT）的活性首次在動物心臟和骨骼肌中被描述。目前，發(fā)現(xiàn)人體內有7種5’-NT，其中5種位于細胞質，1種位于線粒體基質，1種附著在質膜外，附著在質膜外的簡稱為eNT。1985年第四屆國際人類自細胞分化抗原會議中eNT被正式命名為CD73。CD73廣泛表達于人體多種組織細胞表面。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD73在肺癌、胰腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中呈高表達[1]，在缺氧條件下，促使腫瘤微環(huán)境中腺苷聚積，從而發(fā)揮免疫抑制效應[2]。但是迄今為止尚未見任何關于CD73在宮頸癌中的研究報道。因此，本研究利用免疫組織化學法和Western blot檢測宮頸癌組織中CD73蛋白的表達，并研究其可能的臨床意義。本研究旨在為以CD73為分子靶點的宮頸癌的診斷和治療提供新的理論依據。

1 資料與方法

1.1研究對象

選取2010～2012年本院手術切除的74例宮頸癌組織、49例宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neopiasia，CIN）組織和74例正常宮頸上皮組織標本，并經病理、組織學檢查確診。其中隨機選取4例宮頸癌組織[經病理學診斷隨機選取，2例為Ⅱa期（低分化），1例為Ⅰa1期（中分化），1例為Ⅰa2期（高分化）]和自身對應的正常宮頸上皮組織取樣后液氮保存?zhèn)溆?，行Western blot檢測。所有患者術前未接受任何形式的治療，包括放射治療、化學治療和免疫治療?；颊吣挲g25～73歲，中位年齡41歲；其中≥45歲50例，＜45歲24例。按2000年國際婦產科聯(lián)合會（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰa期21例，Ⅰb1期19例，Ⅰb2期21例，Ⅱa期13例。組織學分級：高分化18例，中分化37例，低分化19例。宮頸癌標本中19例伴淋巴結轉移。浸潤深度：≤1/2層36例，＞1/2層28例，全層10例。

1.2免疫組織化學法

CD73鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz，免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（streptavidin-perosidase）SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組織化學法染色步驟參照試劑盒說明書進行操作。CD73一抗稀釋濃度為1∶50，以磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對照，以已知的陽性宮頸癌切片為陽性對照組。

1.3結果評估

以細胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，具體的判定方法依照參考文獻[3]，即按照細胞著色強度和陽性細胞數作為評定方法，隨機計數5個高倍鏡視野，每例標本評價≥1000個細胞。染色強度：輕度著色1分，中度著色2分，強染色3分；陽性細胞＜10%為1分，陽性細胞10%～50%為2分，陽性細胞50%～80%為3分，≥80%為4分。將染色強度與陽性細胞數率相乘得到每例患者的染色總分，1～3分為陰性；4～12分為陽性。

1.4Western blot檢測

將組織從液氮中取出，研磨后用組織蛋白裂解液提取總蛋白，然后將提取的總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳。取下凝膠電轉移到硝酸纖維素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜上，用含5%脫脂奶粉的等滲鹽溶液加Tris-HCl緩沖液封閉NC膜2h，加入一抗CD73 1∶100，4℃搖床孵育過夜，加入相應二抗室溫孵育2 h，將NC膜置于增強化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑中反應1～3 min。暗室中利用X射線曝光，常規(guī)方法顯影定影，顯示特異的蛋白信號，蛋白表達的灰度值利用Image-Pro Pius 5.0軟件進行分析。蛋白相對表達以目的基因與內參基因的比值β-actin作為內參照。每例樣品做3次實驗。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計數資料以率表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1不同宮頸組織中CD73蛋白的表達

免疫組織化學法檢測74例宮頸癌組織、49例宮頸上皮內瘤變組織和74例正常宮頸上皮組織中CD73蛋白表達，結果顯示，CD73蛋白主要定位于宮頸癌細胞的胞質中，呈淺黃色至棕黃色顆粒（見圖1）。CD73蛋白在宮頸癌組織中表達的陽性率為79.7%，顯著高于宮頸上皮內瘤變組織（36.7%）和正常宮頸上皮組織（10.8%），3組CD73蛋白的表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=53.480，P＜0.01）（見表1）。

2.2CD73蛋白表達與臨床病理學參數的相關性

CD73蛋白表達與宮頸癌患者的年齡和組織分化程度無關（P＞0.05），但與臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移關系密切（P＜0.05）。見表2。

圖1 CD73蛋白在不同宮頸組織中的表達

表1 CD73蛋白在宮頸癌、宮頸上皮內瘤變組織及正常宮頸上皮組織中的表達

表2 宮頸頸癌患者臨床病理參數與CD73蛋白表達的相關性

2.3Western blot檢測宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織中CD73蛋白的表達

隨機選取的4例宮頸癌組織中，CD73蛋白的表達顯著高于對應的正常宮頸上皮組織（P＜0.05）。見圖2。

圖2 CD73蛋白在宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織中的表達

3 討論

研究表明，CD73在腫瘤的生長、凋亡、侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用。STAGG等[4]發(fā)現(xiàn)，CD73的活性在惡性程度較高的膀胱癌細胞中顯著增高，證實嘌呤信號途徑促進膀胱腫瘤的形成。ZHI等[5]通過體內外檢測觀察到轉染CD73 siRNA的惡性乳腺癌細胞的生長和轉移能力被明顯抑制，表明CD73在體內外能促進腫瘤細胞的生長。同時WANG等[6]證實CD73還能通過腺苷促進乳腺癌細胞的侵襲和遷移。最近研究發(fā)現(xiàn)，CD73表達上調的白血病T淋巴細胞能特異性地抑制人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導的凋亡，并誘導細胞產生多藥耐藥，從而促進腫瘤細胞的生存。腫瘤細胞CD73高表達與缺氧誘導因子（hypoxia-inducing factor，HIF）、Wnt/13-catenin信號異常、干擾素-α（Interferon-α，IFN-α）及腺苷有關。腫瘤組織內普遍缺氧，缺氧條件可誘導腫瘤細胞內HIF二聚體產生，該二聚體與CD73基因啟動子中缺氧反應元件（hypoxia response element，HRE）結合，促進CD73基因的轉錄[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號中的β-catenin可以通過轉錄因子T細胞因子-β（T-cell factor-β，TCF-β），作用于CD73基因的TCF/淋巴增強因子（lymphoid enhancing factor，LEF）結合位點，強烈增加CD73啟動子的活性，促進基因轉錄[8]。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-α能促進膀胱癌細胞CD73的表達。進一步研究顯示，IFN-α通過間接地誘導其他調控介質來促進CD73基因轉錄[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，腺苷通過激活瘤細胞表面腺苷受體，使細胞內環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）增加，cAMP通過血肌酐結合蛋白與CD73基因的血肌酐結合，從而正反饋性調節(jié)CD73基因的轉錄[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇能夠通過雌激素受體（estrogen receptor，ER）下調CD73基因表達。研究證實，ER是通過CD73基因啟動子中的Sp-1和Ap-2結合位點間接下調CD73基因表達[12]。CD73在多種不同的腫瘤組織和細胞系中表達上調，表明其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但尚未見關于CD73在宮頸癌中的研究報道。

本研究通過分析74例宮頸癌組織、49例宮頸上皮內瘤變組織和74例正常宮頸上皮組織中CD73蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)其CD73蛋白表達的陽性率分別為79.7%、36.7%和10.8%，3組CD73蛋白的表達比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示宮頸癌中高表達的CD73可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，該結果與CD73在其他腫瘤中的表達具有顯著的一致性[4-6]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CD73蛋白表達與宮頸癌患者的年齡、組織分化程度無關（P＞0.05），但與臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移的關系密切（P＜0.05）。利用免疫組織化學法了解CD73蛋白的表達和定位后，本實驗采用更為靈敏的Western blot檢測進一步證實宮癌組織中CD73蛋白的表達。本實驗結果顯示，宮頸癌組織中CD73蛋白的表達顯著高于對應的正常宮頸上皮組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。更為重要的是，本實驗在采用Western blot檢測3號樣品正常宮頸上皮組織時，未發(fā)現(xiàn)CD73蛋白的表達，該結果從某種程度上進一步驗證免疫組織化學法檢測的可靠性。

總之，本研究表明宮頸癌組織中存在高水平的CD73，其高表達與腫瘤的臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移有關，但是其相關的分子機制尚需進一步探討，有望為以CD73為靶點的宮頸癌基因治療提供新的理論依據。

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（童穎丹 編輯）

Expression of CD73 protein in cervical carcinoma tissues and its clinical significance

Xiu－yue XING
(Department of Obstetrics and Gynecology,the Ppeople's Hospital of Qionghai City,Qionghai,Hainan 571400,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of CD73 in cervical carcinoma tissues and its clinical value.【Methods】Immunohistochemistry was used to detect the expression of CD73 in 74 cervical carcinoma tissues,49 cervical intraepithelial neoplasia(CIN)tissues and 74 normal cervical epithelial tissues.The relationships between the expression of CD73 and clinical pathological features were analyzed.The expression of CD73 in randomly selected 4 cervical carcinoma tissues and paired normal cervical epithelial tissues was detected by Western blot.【Results】The positive expression rate of CD73 protein in the cervical carcinoma tissues was significantly higher than that in the CIN tissues and normal cervical epithelial tissue and there were significantly differences among the 3 groups(P＜0.05).The expression of CD73 was not related to the age or histological differentiation(P＞0.05),but closely associated with clinical stage,invasive depth and lymph node metastasis(P＜0.05).Furthermore,Western blot results demonstrated that the level of CD73 in the cervical carcinoma tissues was markedly higher than that in the normal cervical epithelial tissue(P＜0.05).【Conclusion】CD73 may be an important molecular marker for evaluating malignant degree and prognosis of cervical carcinoma.

CD73;cervical carcinoma;prognosis

R737.33

A

1005-8982（2015）32-0055-04

2015-03-09