唐 慧 王朵勤沈燕蕓 徐金華

·論著·

屋塵螨變應原 Derp1對人肥大細胞HMC－1釋放類胰蛋白酶的影響

唐 慧 王朵勤＃沈燕蕓 徐金華?

目的: 明確屋塵螨變應原Derp1對人肥大細胞系HMC－1釋放類胰蛋白酶的影響。方法:培養(yǎng)后的HMC－1細胞分為單純培養(yǎng)液組、5μg/mLDerp1組和5μg/mLDerp1＋100μmol/LPAR2拮抗劑(FSLLY)組，用ELISA方法檢測各組類胰蛋白酶水平，顯微鏡觀察HMC－1細胞脫顆粒率。結(jié)果:培養(yǎng)液組，Derp1組和Derp1＋FSLLRY組中類胰蛋白酶水平分別為31.12±3.60 ng/mL、70.40±1.55 ng/ mL和56.72±2.66 ng/mL。Derp1組和Derp1＋FSLLRY組肥大細胞脫顆粒率分別為66.67%和16.67%。結(jié)論: 屋塵螨變應原Derp1可以通過激活人肥大細胞HMC－1表面PAR2受體引起肥大細胞脫顆粒釋放類胰蛋白酶。

屋塵螨； 肥大細胞； 蛋白酶激活受體2； 類胰蛋白酶

瘙癢幾乎是所有過敏性皮膚病的共同癥狀，尤其是慢性瘙癢可嚴重影響患者的生活質(zhì)量，如何控制慢性瘙癢也是臨床的難題之一。肥大細胞是瘙癢發(fā)生中的關(guān)鍵細胞之一，其活化脫顆粒后可產(chǎn)生多種介質(zhì)，如組胺、類胰蛋白酶等。1類胰蛋白酶是重要的致癢介質(zhì)，通過神經(jīng)源性的機制調(diào)節(jié)皮膚的免疫，并參與瘙癢的發(fā)生。2屋塵螨是引起過敏性皮膚病或其他系統(tǒng)過敏性疾病的最常見的環(huán)境變應原之一。也是蛋白酶激活受體2(PAR2)的天然受體。3因此本實驗旨在研究屋塵螨變應原Derp1通過PAR2信號通路對人肥大細胞HMC－1脫顆粒釋放類胰蛋白酶水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肥大細胞HMC－1細胞株由Butterfield實驗室(Mayo Clinic，Rochester，USA)饋贈，類胰蛋白酶ELISA試劑盒購自美國RND公司，SLIGRL－NH2 (PAR2活化劑)、和FSLLRY(PAR2抑制肽)購自Tocris公司，屋塵螨Derp1購自abnova公司，倒置顯微鏡(Nikon，Japan)，細胞培養(yǎng)箱(Thermo electron co，USA)，胎牛血清(Gibco)，青霉素(Gibco)，Poly－L－lysine(Sigma，USA)。

1.2 人肥大細胞HMC－1培養(yǎng)與激發(fā)4HMC－1細胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，用細胞培養(yǎng)液0%(v/v)胎牛血清(FBS)，20 mmol/L 4－羥乙基哌嗪乙磺酸，0.01%(v/v)硫代甘油，2 mmol/L L－谷氨酰胺，鏈霉素和盤尼西林/青霉素)于37℃、5%(v/v)CO2、濕度為95%的無菌環(huán)境培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的細胞，用血球計數(shù)板計數(shù)，6孔板每孔5×105，設(shè)3個重復，將5μg/mL Derp1、100μmol/L FSLLY＋5μg/

mL Derp1及細胞培養(yǎng)液分別處理細胞，于30 min后終止反應，4℃條件下1500 r/min離心10 min后收集上清置于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ELISA方法檢測類胰蛋白酶水平 用類胰蛋白酶ELISA試劑盒按照操作說明檢測上述實驗收集的上清液中類胰蛋白酶水平。

1.4 人肥大細胞HMC－1脫顆粒率 將HMC－1用Poly－L－lysine固定至載玻片上，用凡士林固定在顯微鏡槽中，在顯微鏡下觀察用 5μg/m L Derp1、100 μmol/L FSLLY＋5μg/mL Derp1及細胞培養(yǎng)液分別處理HMC－1細胞30 min前后觀察細胞形態(tài)變化，對HMC－1細胞的脫顆粒情況進行統(tǒng)計。肥大細胞脫顆粒計數(shù)標準為，肥大細胞細胞膜破裂且有顆粒散落在周圍認為為肥大細胞脫顆粒。脫顆粒率＝脫顆粒肥大細胞/肥大細胞總數(shù)×100%。5

1.5 統(tǒng)計學方法 全部數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05時為有顯著統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 屋塵螨變應原Derp1對人肥大細胞HMC－1釋放類胰蛋白酶水平的影響 見表1、圖1。Derp1和細胞培養(yǎng)液組分別作用于HMC－1 30 min后類胰蛋白酶水平分別為70.40±1.55 ng/mL及31.12±3.60 ng/ mL。經(jīng)統(tǒng)計，屋塵螨變應原Derp1組釋放類胰蛋白酶的水平明顯高于細胞培養(yǎng)液組(P＜0.05)，差別有統(tǒng)計學意義。

表1 不同藥物刺激下人肥大細胞HMC－1釋放類胰蛋白酶的水平

圖1 不同藥物刺激下人肥大細胞HMC－1釋放類胰蛋白酶的水平

2.2 屋塵螨變應原Derp1和PAR2抑制劑FSLLY聯(lián)合作用對人肥大細胞HMC－1釋放類胰蛋白酶水平的影響 見表1、圖1。Derp1與 FSLLY共同作用HMC－1 30 min后類胰蛋白酶水平為56.72±2.66 ng/ mL，較Derp1單獨作用時明顯降低(P＜0.05)，較細胞培養(yǎng)液組依然明顯增高(P＜0.05)，差別有統(tǒng)計學意義。

2.3 屋塵螨變應原Derp1對人肥大細胞HMC－1脫顆粒水平的影響 見圖2a及2b細胞培養(yǎng)液孵育HMC－1 30 min后，顯微鏡視野內(nèi)的細胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，細胞膜表面光滑，見圖3a及3b，Derp1作用于HMC－1 30 min后，細胞發(fā)生了明顯的脫顆粒情況，肥大細胞脫顆粒率為66.67%。

2.4 屋塵螨變應原Derp1和PAR2抑制劑FSLLY聯(lián)合作用對肥大細胞HMC－1脫顆粒水平的影響 見圖4a和4b。相比較于Derp1組，Derp1與FSLLRY共同作用于HMC－1 30 min后，細胞脫顆粒情況被明顯抑制，肥大細胞脫顆粒率為16.67%。

3 討論

過敏性皮膚病是皮膚科的常見病，發(fā)病率逐年增多，部分患者還同時合并哮喘或過敏性鼻炎等其他過敏性疾病。常見的過敏性皮膚病中，瘙癢是其共同的癥狀，但是目前針對慢性瘙癢卻缺乏切實有效的治療手段。反復的瘙癢－搔抓的惡性循環(huán)除了會加劇皮疹之外，還會嚴重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。因此如何防治慢性瘙癢應當是目前皮膚科的研究重點之一。

以往大規(guī)模的變應原檢測，發(fā)現(xiàn)吸入性變應原(主要是屋塵螨和粉塵螨)是引起過敏性皮膚病的重要誘因6而且在具有慢性瘙癢的特應性皮炎等疾病中，持續(xù)性的接觸屋塵螨與疾病的加重有關(guān)。7既往研究認為，屋塵螨可通過I型變態(tài)反應誘導肥大細胞釋放組胺引起瘙癢，但這只能解釋部分情況。8現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)屋塵螨的提取物通過活化PAR－2，可導致呼吸道黏膜下腺體的分泌增加，并可以引起肺的感覺神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流增加，9，10由此可見屋塵螨可以通過與PAR－2的作用參與疾病的發(fā)生。PARs屬于與G蛋白偶聯(lián)受體家族，有四個成員:PAR1、PAR2、PAR3和PAR4。11，12PAR2分布于各種組織和細胞表面，主要包括人皮膚肥大細胞、上皮細胞、活化的內(nèi)皮細胞、肌細胞、神經(jīng)元和星形細胞等。9，10肥大細胞是瘙癢發(fā)病中的關(guān)鍵細胞之一，其釋放的組胺和類胰蛋白酶都是重要的致瘙癢的介質(zhì)，尤其是后者與慢性瘙癢密切相關(guān)。13因此我們針對屋塵螨變應原－PAR2信號通路－肥大細胞－類胰蛋白酶途徑進行研究，以期闡明這一途徑的分子機制。

圖2 細胞培養(yǎng)液孵育30min后，顯微鏡視野內(nèi)的人肥大細胞HMC－1處于穩(wěn)定狀態(tài)，細胞膜表面光滑 a:細胞培養(yǎng)液孵育前；b:細胞培養(yǎng)液孵育30min后 圖3 屋塵螨變應原Derp1孵育后，人肥大細胞HMC－1發(fā)生了明顯的脫顆粒情況 a:屋塵螨變應原Derp1孵育前；b:屋塵螨變應原Derp1孵育30 min后 圖4 屋塵螨變應原Derp1與拮抗劑FSLLRY共同孵育后，人肥大細胞HMC－1脫顆粒情況被明顯抑制 a:屋塵螨變應原Derp1與拮抗劑FSLLRY共同孵育前；b:屋塵螨變應原Derp1與拮抗劑FSLLRY共同孵育30 min后

本實驗研究發(fā)現(xiàn)PAR2激活劑SLIGRL－NH2可明顯引起人肥大細胞HMC－1類胰蛋白酶釋放，證實了HMC－1細胞表面PAR2受體的存在。屋塵螨變應原Derp1單獨作用于HMC－1細胞可明顯引起HMC－1細胞脫顆粒釋放類胰蛋白酶，其水平明顯高于正常對照，表明屋塵螨變應原Derp1是人肥大細胞HMC－1活化的重要刺激物。而將屋塵螨變應原Derp1與PAR2拮抗劑FSLLRY共同作用于HMC－1細胞時，可部分抑制HMC－1細胞脫顆粒引起類胰蛋白酶的釋放，因此我們認為屋塵螨變應原Derp1可以通過激活人肥大細胞HMC－1表面PAR2受體引起肥大細胞脫顆粒釋放類胰蛋白酶，但這并不是唯一途徑。本研究通過對屋塵螨變應原－PAR2信號通路－肥大細胞－類胰蛋白酶這一途徑的研究，明確其在慢性瘙癢中所發(fā)揮的作用及其分子機制，從而為臨床新的治療提供切實的理論基礎(chǔ)，為真正解決臨床實際問題提供幫助。

1Xie H，He SH.Roles of histamine and its receptors in allergic and inflammatory bowel diseases.World J Gastroenterol，2005，11:2851－2857.

2Ribatti D，Ranieri G.Tryptase，a novel angiogenic factor stored inmast cell granules.Exp Cell Res，2015，332(2):157－162. 3 Steinhoff M，Buddenkotte J，Shpacovitch V，et al.Proteinaseactivated receptors:transducers ofproteinase－mediated signaling in inflammation and immune response.Endocr Rev，2005，26:1－43.

4Wang L，Ding G，Gu Q，et al.Single－channel properties of a stretch－sensitive chloride channel in the human mast cell line HMC－1.Eur Biophys J，2010，39(5):757－767.

5 Zhang D，Spielmann A，Wang L，etal.Mast－cell degranulation induced by physical stimuli involves the activation of transientreceptor－potential channel TRPV2.Physiol Res，2012，61(1): 113－124.

6秦曉蕾，徐金華，唐慧，等.1195例過敏性皮膚病變應原皮膚點刺試驗結(jié)果分析.中國麻風皮膚病雜志，2007，23(11):941－943.

7 Choi JS，Ryu HR，Yoon CH，et al.Treatment of patients with refractory atopic dermatitis sensitized to house dustmites by using sublingual allergen immunotherapy.Ann Dermatol，2015，27 (1):82－86.

8 Rajan TV.The Gell－Coombs classification of hypersensitivity reactions:a re－interpretation.Trends Immunol，2003，24:376－379.

9 Cho HJ，Lee HJ，Kim SC，et al.Protease－activated receptor 2－dependent fluid secretion from airway submucosal glands by house dustmite extract.JAllergy ClinImmunol，2012，129(2): 529－535.

10 Gu Q，Lee LY.House dustmite potentiates capsaicin－evoked Ca(2＋)transients inmouse pulmonary sensory neurons via activation of protease－activated receptor－2.Exp Physiol，2012，

97(4):534－543.

11D’Andrea MR，Rogahn CJ，Andrade－Gordon P.Localization of protease－activated receptors－1 and－2 in humanmast cells: indications for an amplified mast cell degranulation cascade. Biotech Histochem，2000，75(2):85－90.

12 Shpacovitch VM，Brzoska T，Buddenkotte J，et al.Agonists of proteinase－activated receptor 2 induce cytokine release and activation of nuclear transcription factor kappaB in human dermal microvascular endothelial cells.J Invest Dermatol，2002，118: 380－385.

13 Kempkes C，Buddenkotte J，Cevikbas F，etal.Role of PAR－2 in Neuroimmune Communication and Itch.Itch:Mechanisms and Treatment.Boca Raton(FL):CRC Press，2014，Chapter 11. (收稿:2015－01－23 修回:2015－02－21)

Effect of house ductm ite Derp1 on the secretion of tryptase from human mast cell line HMC－1

TANG Hui，WANGDuo-qin，SHEN Yan-yun，et al.Department ofDermatology，Huashan Hospital，F(xiàn)udan U-niversity，Shanghai，200040

Objective:To determine the effect of house dustmite Derp1 on the secretion of typtase from human mast cell line HMC－1.Methods:After cultured HMC－1 cellswere incubated respectivelywith Derp1 5μg/mL and Derp1 5μg/mL＋PAR2 antagonist(FSLLY)100μmol/L.The level of typtase from HMC－1 cells was detected by ELISA.The degranulation of HMC－1 cells was observed under microscope.Results: The levels of the typtase from HMC－1 cells in culturemedium group，Derp1 group and Derp1 combined FSLLY group were 31.12±3.60 ng/mL，70.40±1.55 ng/mL and 56.72±2.66 ng/mL，respectively.The degranulation rates in Derp1 group and Derp1 combined FSLLY group were 66.67%and 16.67%.Conclusion:The PAR2 receptor can be activated by house dustmite Derp1，which results in typtase secretion of the human mast cell line HMC－1.

house dustmite；mast cell；protease activated receptor 2；typtase

國家自然科學基金青年項目(編號:81402603)上海市衛(wèi)生局青年科研項目(編號:20124y032)

復旦大學附屬華山醫(yī)院，上海，200040＃為共同第一作者?通信作者