侯改成，譚艾娟*，呂世明，金曉峰，張劍勇

（1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.貴州省獸藥監(jiān)察所，貴州 貴陽(yáng) 550003）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)牛乳中4 種驅(qū)蟲(chóng)藥物殘留

侯改成1，譚艾娟2,*，呂世明3，金曉峰4，張劍勇4

（1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.貴州省獸藥監(jiān)察所，貴州 貴陽(yáng) 550003）

建立同時(shí)檢測(cè)牛乳中4 種驅(qū)蟲(chóng)藥物（吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素）殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法。樣品經(jīng)乙腈提取，堿性氧化鋁固相萃取小柱凈化，采用UPLC ACQUITY BEH C18柱，以0.1%甲酸-乙腈（A）和0.1%甲酸-5.0 mmol/L乙酸銨（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫分離，在電噴霧正離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式檢測(cè)。結(jié)果表明：4種驅(qū)蟲(chóng)藥物在5～100 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.996，加標(biāo)樣品的平均回收率為76.4%～113.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為2.4%～10.6%。吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素的檢出限分別為1.0、2.5、2.5、2.5 μg/kg。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可以同時(shí)檢測(cè)牛乳中吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素殘留。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；吡喹酮；阿維菌素類(lèi)藥物；殘留；牛乳

阿維菌素類(lèi)藥物是由鏈霉菌產(chǎn)生的一組大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，是目前公認(rèn)的高效、廣譜抗寄生蟲(chóng)類(lèi)藥物[1]。阿維菌素類(lèi)藥物主要包括阿維菌素、伊維菌素和多拉菌素[2]，該類(lèi)藥物對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的線(xiàn)蟲(chóng)和體外吸血昆蟲(chóng)有極強(qiáng)的驅(qū)殺作用[3]，但對(duì)吸蟲(chóng)和絳蟲(chóng)無(wú)效[4]。該類(lèi)化合物對(duì)未成年人的腦和脊髓有較強(qiáng)的毒性，甚至?xí)鹚劳鯷5]。美國(guó)、歐盟、日本和中國(guó)等均制定了限定阿維菌素類(lèi)藥物殘留的相關(guān)規(guī)定[6-7]。吡喹酮是驅(qū)除動(dòng)物體內(nèi)吸蟲(chóng)和絳蟲(chóng)的首選藥[8]，但在食品中的殘留會(huì)引發(fā)諸多的副作用，給人類(lèi)的生命健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅[9-10]。

由于奶牛為食草動(dòng)物，多為線(xiàn)蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、吸蟲(chóng)以及各種體外寄生蟲(chóng)混合感染[11]，使用單一藥物驅(qū)蟲(chóng)效果不理想，臨床上常常將阿維菌素類(lèi)藥物與吡喹酮聯(lián)合用于奶牛體內(nèi)蠕蟲(chóng)和體外寄生蟲(chóng)的驅(qū)除，驅(qū)蟲(chóng)效果好，簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)[12-14]，因此，牛乳中同時(shí)出現(xiàn)此兩類(lèi)藥物殘留的機(jī)率較高，目前牛乳中獸藥殘留的檢測(cè)主要涉及氟喹諾酮類(lèi)藥物、β-類(lèi)酰胺類(lèi)藥物、氯霉素、黃曲霉毒素等，有關(guān)阿維菌素類(lèi)藥物和吡喹酮檢測(cè)方法的研究報(bào)道較少[15-17]，還未見(jiàn)到同時(shí)檢測(cè)牛乳中此兩類(lèi)藥物殘留的相關(guān)報(bào)道。本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛乳中吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素藥物殘留的方法，該方法為鮮乳生產(chǎn)企業(yè)、乳產(chǎn)品加工企業(yè)和食品安全監(jiān)管部門(mén)加強(qiáng)原料乳收儲(chǔ)、產(chǎn)品質(zhì)量控制，降低牛乳中阿維菌素類(lèi)藥物和吡喹酮?dú)埩舻奈：Α⒈Ｕ吓Ｈ榘踩峁┘夹g(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吡喹酮（純度99.5%）、阿維菌素（純度95.0%）、多拉菌素（純度96.0%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；伊維菌素（純度93.9%） 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；甲醇、乙腈（色譜純） 德國(guó)Merck公司；甲酸（色譜純）上海安譜科學(xué)儀器有限公司；水為超純水；正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸銨、氯化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC超高效液相色譜、Quattro Premier XE三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司；堿性氧化鋁固相小柱（500 mg/6 mL） 天津博納艾杰爾科技有限公司；氮?dú)獯蹈蓛x 美國(guó)Organomation公司；3K15離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；渦旋混合器 德國(guó)IKA公司；XS105電子天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解于100 mL棕色容量瓶中，4 ℃條件下避光保存[18]，備用。使用前移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成所需質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g樣品（精確至0.01），置于50 mL離心管中，先加入5 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋混勻，繼續(xù)加入5 mL×2乙腈，渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min，合并二次上清液至堿性氧化鋁固相小柱上，凈化液收集于50.0 mL氮吹管中，45 ℃氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1.0 mL乙腈，充分渦旋并超聲溶解后過(guò)0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧（electrospray ionization，ESI）正離子源；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：3.5 eV；離子源溫度：120 ℃；溶劑氣溫度：350 ℃。

表1 吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素的質(zhì)譜參數(shù)Table1 Mass spectral parameters for PZQ IVR AVB and DOR

1.3.4 色譜條件

Waters UPLC ACQUITY BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A：乙腈-0.1%甲酸；流動(dòng)相B：0.1%甲酸-5.0mmol/L乙酸銨；梯度洗脫程序：0～1.0 min，50% B；1.0～3.5 min，90% B；3.5～3.7 min，90% B；3.7～4.3 min，50% B。柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

4 種驅(qū)蟲(chóng)藥物均屬弱極性化合物，在乙酸乙酯、乙腈等有機(jī)溶劑中有較高的溶解度。實(shí)驗(yàn)考察A為乙酸乙酯，B為乙腈，C為乙腈-二氯甲烷（8∶2，V/V），D為乙腈-二氯甲烷（6∶4，V/V），4 種提取劑在添加量為5 μg/kg的提取效率，如表2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯容易引起乳化，回收率普遍較低；在乙腈中加入不同比例的二氯甲烷雖有助于沉淀蛋白和水相的分離，但回收率也普遍較低，并對(duì)人和環(huán)境危害較大[19]；通過(guò)加入飽和氯化鈉改善有機(jī)相和水相的分離[20]，再經(jīng)乙腈提取后4 種驅(qū)蟲(chóng)藥物的回收率普遍較高，且雜質(zhì)少，基質(zhì)干擾小。

表2 4 種提取劑的提取效率對(duì)比（n==66）Table2 Comparison ofnn == 66))

2.2 凈化方法的確定

凈化方法主要包括固相萃取和液液萃取[21]。固相萃取選用堿性氧化鋁固相萃取小柱，液液萃取選用正己烷，由于正己烷在乙腈中有一定的溶解度，考慮到上機(jī)溶液需與流動(dòng)相有良好的適配性，因此選用乙腈飽和的正己烷凈化。堿性氧化鋁固相萃取小柱能更有效地凈化富含脂肪的牛乳樣品，降低非極性雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，消除了基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾，效果較理想。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 4 種驅(qū)蟲(chóng)藥物在添加量10 10μg/kg的牛乳中的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 4 parasiticides spiked in milk at 10 μg/kg

質(zhì)譜檢測(cè)主要采用ESI—和ESI＋模式。ESI—靈敏度較低，阿維菌素類(lèi)藥物均未檢出。ESI＋又分為[M＋Na]＋和[M＋NH4]＋模式，結(jié)果表明，[M＋Na]＋的離子化效率和響應(yīng)值雖然很高，但基質(zhì)標(biāo)樣中目標(biāo)物的響應(yīng)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于溶劑標(biāo)樣中目標(biāo)物的相應(yīng)值，且重復(fù)檢測(cè)后響應(yīng)值衰減很快。[M＋NH4]＋模式的靈敏度高，樣品基質(zhì)的離子抑制較小。選擇加入5 mmol/L乙酸銨可以提高離子化效率，增強(qiáng)穩(wěn)定性。以分離時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)豐度為縱坐標(biāo)，4 種驅(qū)蟲(chóng)藥物在添加量為10 μg/kg的牛乳中的提取離子色譜圖如圖1所示。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

綜合考察甲醇和乙 腈的色譜分離效果和組分進(jìn)入質(zhì)譜前的離子化效率。與甲醇相比，以乙腈作為流動(dòng)相，色譜峰響應(yīng)值高，對(duì)稱(chēng)性好，但離子化效率卻較低。結(jié)果表明，在乙腈中加入0.1%的甲酸，能有效促進(jìn)化合物的電離，峰形較理想。

2.5 線(xiàn)性范圍與檢出限

用乙腈配制系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)選取不含目標(biāo)化合物的空白奶樣，按1.3.2節(jié)處理后配制成一系列同溶劑標(biāo)樣質(zhì)量濃度相同的基質(zhì)標(biāo)樣，以信噪比為3的條件下確定方法檢出限，以信噪比為10的條件下確定方法定量限。分別以標(biāo)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果表明，在5～100 ng/mL范圍內(nèi)，溶劑標(biāo)樣和基質(zhì)標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性良好（R2＞0.996）。用基質(zhì)與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率的比值反映基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱[22]，見(jiàn)表3。結(jié)果表明，牛乳對(duì)吡喹酮和阿維菌素的基質(zhì)效應(yīng)較為明顯，吡喹酮表現(xiàn)為增強(qiáng)效應(yīng)，而阿維菌素則表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行校正，消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定牛乳中伊維菌素的最大殘留限量為10 μg/kg[23]，本方法對(duì)吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素的檢出限分別為1.0、2.5、2.5、2.5 μg/kg，因此，本方法完全滿(mǎn)足上述藥物的實(shí)際檢測(cè)要求。

表3 4 種驅(qū)蟲(chóng)藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、相關(guān)系數(shù)（R2）、斜率比值、檢出限與定量限TTaabbllee 33 SSttaannddard curves in matrix and solvent with correlation coefficient (R2) and slope ratio LODs and LOQs for 4 parasiticides

2.6 方法準(zhǔn)確度和精密度

在空白樣品中添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，相當(dāng)于5、10、20 μg/kg 3個(gè)添加量，每一個(gè)添加水平重復(fù)6 次，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行處理并測(cè)定。由表4可見(jiàn)，4 種驅(qū)蟲(chóng)類(lèi)藥物的平均回收率為76.4%～113.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～10.6%，符合多組分痕量殘留檢測(cè)的要求。

表4 樣品加標(biāo)回收率及精密度（n==66）Table4 Recoveries(nn == 66))

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)采自貴州省規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的15 份牛乳樣品進(jìn)行測(cè)定，僅1 份檢出多拉菌素（3.8 μg/kg，我國(guó)規(guī)定泌乳期禁用），而吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素均未檢出。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)牛乳中吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素和多拉菌素殘留的方法，并對(duì)提取劑、凈化方法、色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終建立了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，滿(mǎn)足牛乳中吡喹酮、伊維菌素、阿維菌素和多拉菌素殘留的測(cè)定。

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Simultaneous Determination of 4 Parasiticide Residues in Milk by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HOU Gaicheng1′TAN Aijuan2′*′L Shiming3′JIN Xiaofeng4′ZHANG Jianyong4
(1. College of Pharmacy Guizhou University Guiyang 550025′China; 2. College of Life Science Guizhou University Guiyang 550025′China; 3. College of Animal Science Guizhou University Guiyang 550025′China; 4. Guizhou Province Institute of Veterinary Drugs Control Guiyang 550003′China)

A new multi-residue analytical method was developed for the simultaneous determination of residues of 4 parasiticides i.e praziquantel ivermectin abamectin and doramectin in milk by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS). The samples were extracted with acetonitrile and then cleaned up with alkaline alumina column The target compounds were separated with UPLC ACQUITY BEH C18column The mobile phase A (acetonitrile plus 0.1% formic acid and the mobile phase B (0.1% formic acid plus 5 mmol/L ammonium acetate were used in a gradient elution program The target drugs were detected by electrospray ionization mass spectrometry in positive ion mode with multiple reaction monitoring The results showed good linear relationships in the range of 5-100 ng/mL and the correlation coefficients were all above 0.996. The average recoveries ranged from 76.4% to 113.3%′and the relative standard deviations (RSDs were in the range of 2.4%-10.6%. The limits of detection (LODs for praziquantel ivermectin abamectin and doramectin were 1.0′2.5′2.5′and 2.5 μg/kg respectively The method was simple rapid and accurate to measure the residues of these four parasiticides praziquantel ivermectin abamectin and doramectin in milk.

UPLC-MS-MS; praziquantel; avermectins; residue; milk

TS207.3

A

1002-6630（2015）06-0216-04

10.7506/spkx1002-6630-201506041

2014-05-30

貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)課題（黔科合NZ字[2012]3011號(hào)）；貴陽(yáng)市農(nóng)委科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（筑科合（2009第12-1號(hào)））

侯改成（1987—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锘钚晕镔|(zhì)。E-mail：gaichenghou_123@126.com

*通信作者：譚艾娟（1963—），女，教授，研究方向?yàn)槲⑸锱c生化藥學(xué)。E-mail：ajtan@gzu.edu.cn