林建原，賈康茗，李 堯

（浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

花蛤中糖胺聚糖的分離與結(jié)構(gòu)鑒定

林建原，賈康茗，李 堯

（浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

目的：以花蛤?yàn)樘崛≡?，用多酶水解法提取花蛤中糖胺聚糖，利用紅外光譜法對(duì)提取物中的硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。采用超高效液相色譜與電噴霧-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)糖胺聚糖類組分進(jìn)行研究。方法：色譜柱ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m）；保護(hù)柱ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard（2.1 mm×5 mm，1.7 ?m）；流動(dòng)相乙腈-水（體積分?jǐn)?shù)0.2%冰醋酸）的體積比為75∶25；流速0.1 mL/min；進(jìn)樣20 μL。結(jié)果：超高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜法可快速定性分離糖胺聚糖組分。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)為糖胺聚糖化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供了一種有效的分析方法。

花蛤；糖胺聚糖；硫酸軟骨素；超高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜；紅外光譜

糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs），也叫黏多糖、硫酸酯多糖、結(jié)締組織多糖，為雜多糖的一種，主要存在于高等動(dòng)物結(jié)締組織中，植物中也有發(fā)現(xiàn)。GAGs是動(dòng)物中蛋白聚糖的糖鏈部分，是多聚陰離子，為長鏈不分支的糖，具有羧基和硫酸基團(tuán)[1]，是一類由重復(fù)的二糖結(jié)構(gòu)單元組成的帶有負(fù)電荷的長鏈大分子物質(zhì)[2]。常見的GAGs有透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸皮膚素、肝素和硫酸乙酰肝素等。GAGs分子是呈酸性的，其原因是GAGs分子中含有己糖醛酸并連有硫酸基團(tuán)。GAGs因具有抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、降血脂、增強(qiáng)免疫等生理活性[3-6]，已成為學(xué)術(shù)界矚目的一類生物高分子。近年來，國內(nèi)外對(duì)大西洋鰩[7]、海星[8]、扇貝[9]等的GAGs進(jìn)行了研究。貝類在提取過程中，主要采用酶進(jìn)行酶解[10-12]，以酶解產(chǎn)物為原料提取GAGs，進(jìn)而測定GAGs的含量。

近年來，超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography UPLC）作為一種新興的色譜分析手段，被廣泛應(yīng)用到與質(zhì)譜聯(lián)用中[13]，且UPLC具有高速、高分離度、低消耗等特點(diǎn)[14]，特別是針對(duì)GAGs的結(jié)構(gòu)分析[15]，更具有顯著的優(yōu)勢。張小軍[16]利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對(duì)GAGs的二糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。GAGs的定量分析方法主要以比色法[17]、HPLC法和電泳法為主[18-19]。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-電噴霧-質(zhì)譜（UPLC-electrospray-mass spectrometry，UPLC-ESI-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)扇貝GAGs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開發(fā)貝類多糖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)樣品 美國阿拉丁公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；枯草桿菌中性蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；花蛤粉末 自制；乙腈為色譜純，色譜實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；十萬分之一分析天平 Sartorius科學(xué)儀器（北京）有限公司；AE200S萬分之一天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；Acquity UPLC超高壓液相色譜儀、Acquity UPC2質(zhì)譜檢測器 美國Waters公司；Vertex70傅里葉紅外光譜儀 德國Brüker公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜分離條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1mm× 100 mm，1.7 ?m）；保護(hù)柱：ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard（2.1 mm×5 mm，1.7 ?m）；采用二元線性梯度洗脫：流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.2%冰醋酸溶液；流動(dòng)相B為乙腈；流動(dòng)相梯度組成列于表1；流速0.1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 ?L。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相比例Table1 Solvent composition of HPLC mobile phase hase

1.3.2 色譜與質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源（負(fù)離子）；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 000；毛細(xì)管電壓3.80 kV；錐孔電壓25.00 V；錐孔氣流量45 L/h；提取電壓2.00 V；離子源溫度150℃；脫溶劑氣溫度300℃；脫溶劑氣流量300 L/h。

1.3.3 花蛤中硫酸軟骨素的提取

稱取花蛤粉末5.000 g，以固液比1∶3（g/mL）的比例溶于蒸餾水。先后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.3%胃蛋白酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.4%胰蛋白酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行酶解。酶解后取酶解液加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇進(jìn)行醇沉24 h。醇沉后取沉淀用乙醇、丙酮交替洗脫3 次干燥得硫酸軟骨素。將硫酸軟骨素配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%糖液，用稀堿將pH值調(diào)至2.0，去沉淀，再將pH值調(diào)至7.0去沉淀。上清液透析48 h。加入體積分?jǐn)?shù)5%無水NaAc溶液和1.5 倍體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，使醇量達(dá)60%，醇沉24 h。棄上清液，沉淀干燥后得GAGs-1。將GAGs-1配制成1%糖液，透析48 h，加入乙醇-乙酸鈉試劑，使乙醇量達(dá)60%，醇沉24 h。棄上清液，沉淀干燥后得GAGs-2。GAGs-2置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 溶液的配制

硫酸軟骨素鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品0.004 g，用1.4%復(fù)合酶酶解，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

取硫酸軟骨素二糖儲(chǔ)備液于1 cm比色皿中，以0.1 mol/L Tris-HAc（pH 9.1）緩沖液為參比，掃描測定波長180～600 nm的紫外-可見吸收曲線，得到化合物的紫外-可見吸收光譜。硫酸軟骨素的最大吸收波長在228 nm處，因此本實(shí)驗(yàn)選擇228 nm為硫酸軟骨素二糖的檢測波長。

2.2 花蛤中GAGs的液相色譜分析

花蛤中提取的GAGs酶解液的HPLC圖，如圖1所示，在實(shí)驗(yàn)色譜條件下得以分離，經(jīng)與標(biāo)樣對(duì)比，確定峰3為硫酸軟骨素。

圖1 樣品的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of GAGs extracted from hard clams

2.3 花蛤中GAGs質(zhì)譜

硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)樣品ΔDi-4S、ΔDi-6S的質(zhì)譜圖見圖2。圖1中峰1、2的質(zhì)譜圖見圖3。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)樣品ΔDi-4S（A）、ΔDi-6S（B）的質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectra of ΔDi-4S and ΔDi-6S standards

圖3 樣品酶解產(chǎn)物峰1（A）、2（B）的質(zhì)譜圖Fig.3 MS spectra of peaks 1 and 2 of the enzymatic hydrolysate of hard clams

圖2 中硫酸軟骨素二糖電離后產(chǎn)生的分子離子峰，m/z 458是單硫酸二糖的準(zhǔn)分子離子峰[M—H]—，ΔDi-4S（ΔGlcUA-[1→3]-GalNAc-4S）、ΔDi-6S（ΔGlcUA-[1→3]-GalNAc-6S）由于質(zhì)量數(shù)均為459，因此難以通過準(zhǔn)離子峰將其區(qū)分開來，其差別主要體現(xiàn)在碎片離子上。Begona等[19]對(duì)這2 種硫酸軟骨素二糖的質(zhì)譜研究表明，ΔDi-4S的特征碎片峰表現(xiàn)為離子豐度m/z 300大于m/z 282或不存在m/z 282，而ΔDi-6S的特征碎片峰表現(xiàn)為離子豐度m/z 282大于m/z 300或不存在m/z 300。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)，ΔDi-4S和ΔDi-6S的質(zhì)譜碎片峰同樣表現(xiàn)出以上特征。ΔDi-4S的質(zhì)譜圖中m/z 300豐度較高但不含m/z 282，ΔDi-6S的質(zhì)譜圖中m/z 282豐度較高，大于m/z 300。圖3A中僅出現(xiàn)m/z 300，而無m/z 282，正是ΔDi-4S特征的體現(xiàn)；而圖3B中僅出現(xiàn)m/z 282，而無m/z 300，體現(xiàn)出ΔDi-6S特征。結(jié)果表明，通過質(zhì)譜分析可實(shí)現(xiàn)花蛤中GAGs的結(jié)構(gòu)鑒定。

2.4 花蛤中GAGs紅外光譜分析

對(duì)花蛤GAGs提取物在500～4 000 cm—1波數(shù)范圍內(nèi)掃描測試，其結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖4。在波數(shù)3 429 cm—1附近有強(qiáng)吸收，說明有多糖羥基（—OH）；在2 927cm—1波數(shù)處有吸收，說明有—CH3的C—H伸縮振動(dòng)；在1 639cm—1附近有強(qiáng)吸收，說明有乙酰氨基（—NHCOCH3—）的存在；在波數(shù)1 418 cm—1附近有吸收，說明有羧基（—COO—）存在；在波數(shù)1 264 cm—1附近有吸收，說明有硫酸基（—O—SO3—）存在；在波數(shù)700.82 cm—1說明在氨基己糖上有硫酸酯鍵的連接。以上現(xiàn)象均說明該提取物具備硫酸軟骨素的基本特征[20-22]?；ǜ騁AGs的紅外光譜圖分析的官能團(tuán)見表2。由圖4、表2分析可知，花蛤GAGs含有羥基、酰胺基、硫酸基、氨基。

圖4 花蛤提取物的紅外光譜測定Fig.4 IR spectrum of hard clam extract

表2 花蛤GAGs紅外光譜圖分析Table2 IR spectral analysis of GAGs extracted from hard clams

2.5 硫酸軟骨素的線性關(guān)系

用800 mg/L硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次稀釋為400、200、100、50 mg/L和25 mg/L，在選定的檢測條件下，分別由低質(zhì)量濃度向高質(zhì)量濃度進(jìn)樣分析。以峰面積對(duì)應(yīng)軟骨素質(zhì)量濃度ρ（mg/L）作線性回歸，得回歸方程為ρ=0.23A＋0.39，相關(guān)系數(shù)為0.999 9；說明硫酸軟骨素在25～400 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系。并由色譜峰面積計(jì)算可得ΔDi-4S的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%，ΔDi-6S的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.3%。

3 結(jié) 論

GAGs是生物組織中重要的活性大分子，通過酶解方法提取其有效成分，獲得GAGs種類、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等方面的信息[23]，對(duì)研究其生物學(xué)性質(zhì)至關(guān)重要[24-25]。本研究采用UPLC-ESI-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)花蛤中GAGs類組分進(jìn)行分離與結(jié)構(gòu)鑒定，方法行之有效，利于批量樣品的快速分離與測定。

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Separation and Structure of Glycosaminoglycans from the Hard Clam Meretrix meretrix

LIN Jianyuan JIA Kangming LI Yao
(College of Biological and Environmental Sciences Zhejiang Wanli University Ningbo 315100′China)

Objective To extract glycosaminoglycans (GAGs from hard clams (Meretrix meretrix by multi-enzymatic hydrolysis and to analyze the structure of chondroitin sulfate in the extract by infrared (IR spectroscopy Methods The components of GAGs were examined by ultra high performance liquid chromatography-electrospray-mass spectrometry (UPLC-ESI-MS using an ACQUITY UPLC BEH Amide chromatographic column (2.1 mm × 100 mm′1.7 ?m and an ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard guard column (2.1 mm × 5 mm′1.7 ?m). The mobile phase was composed of a mixture of water and methanol (75:25′V/V containing 0.2% glacial acetic acid at a flow rate of 0.1 mL/min The injection volume was set as 20 μL Results Rapid separation of the components was achieved and their structures were determined by UPLC-ESI-MS Conclusion This paper provides an effective method to identify the structure of GAGs.

hard clams glycosaminoglycans chondroitin sulfate ultra high performance liquid chromatographyelectrospray-mass spectrometry (UPLC-ESI-MS); infrared spectroscopy (IR)

S931

A

1002-6630（2015）06-0183-04

10.7506/spkx1002-6630-201506034

2014-08-07

浙江省科技廳分析測試項(xiàng)目（2012C37026）；浙江省現(xiàn)代微生物技術(shù)與應(yīng)用重中之重學(xué)科資助項(xiàng)目（ZS2013010）

林建原（1965—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取及分析檢測。E-mail：linjianyuan33@163.com