呂軍偉，楊賢慶*，林婉玲，李來好，馬海霞，魏 涯

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品 學(xué)院，上海 201306）

響應(yīng)面法優(yōu)化藻油中抗氧化劑的復(fù)配組合

呂軍偉1′2，楊賢慶1′*，林婉玲1，李來好1，馬海霞1，魏 涯1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品 學(xué)院，上海 201306）

為了提高藻油氧化穩(wěn)定性，對添加在藻油中的抗氧化劑組合進(jìn)行優(yōu)化。利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)并結(jié)合響應(yīng)面分析法，以迷迭香粉（≥30%鼠尾草酸）、VE、VC棕櫚酸酯添加量為試驗(yàn)因素，以藻油過氧化值（peroxide value，POV）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值及二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量為響應(yīng)值，并進(jìn)行二次回歸設(shè)計(jì)建立模型，得到的最佳抗氧化劑組合為：迷迭香粉0.37‰、VE 0.11‰、VC棕櫚酸酯0.20‰。該優(yōu)化條件下藻油經(jīng)過12 d烘箱實(shí)驗(yàn)后測得POV為9.26 meq/kg，TBA為0.35 mg/kg，DHA含量為30.27%，其與模型預(yù)測值相吻合，表明所建立的回歸模型是切實(shí)可行的。

藻油；抗氧化劑；響應(yīng)面法

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）有腦黃金之稱，隸屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸。當(dāng)前魚油和藻類是DHA提取的主要來源，但從魚油中提取的DHA有腥味、膽固醇含量高，且受污染率較高，而DHA藻油恰好克服了魚油的這些弱點(diǎn)，且具有培養(yǎng)周期短、生長速率快、生物積累量高、營養(yǎng)價(jià)值高及占地面積少等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。DHA具有明目抗癌、健腦益智、消炎以及抗衰老等功能特性，在生理學(xué)、醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域具有非常廣泛的應(yīng)用[3-10]。DHA為高度不飽和脂肪酸，對溫度、光照、空氣、金屬離子等外界因素很敏感，極易被氧化，氧化后產(chǎn)物對身體有一定危害作用?？寡趸瘎┦欠乐故称费趸冑|(zhì)的一種食品添加劑，能為易氧化物質(zhì)提供氫原子，捕獲并中和自由基，從而延緩食或防止食品被氧化。因此，通過添加抗氧化劑防止油脂被氧化是經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的方法。目前油 脂中常用的抗氧化劑有叔丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、叔丁基對苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、二叔丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）等，這些抗氧化劑價(jià)格低廉，但安全性受到質(zhì)疑[11-13]，在嬰幼兒食品及保健領(lǐng)域受到限制，所以天然抗氧化劑的使用是當(dāng)前食品抗氧化領(lǐng)域發(fā)展的一種必然。另外多項(xiàng)研究[14-15]表明，復(fù)合抗氧化劑的使用效果明顯優(yōu)于單一抗氧化劑的抗氧化作用。因此，本實(shí)驗(yàn)在借鑒抗氧化劑國家限量標(biāo)準(zhǔn)使用范圍的基礎(chǔ)上，以過氧化值（peroxide value，POV）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值和DHA含量作為油脂氧化穩(wěn)定性的評價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)并結(jié)合響應(yīng)面分析法對3 種抗氧化劑迷迭香粉、VE和VC棕櫚酸酯的復(fù)配組合進(jìn)行優(yōu)化，探究其對藻油穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DHA藻油 廣東潤科生物工程有限公司；迷迭香粉（≥30%鼠尾草酸） 廣州三元科技有限公司；VE 日本TCI公司；VC棕櫚酸酯 廣州齊云公司；三氟化硼-甲醇溶液 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；鐵粉、氯化亞鐵、三氯甲烷、硫氰酸鉀、甲醇、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、氫氧化鉀等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 POV測定

參考GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》測定POV[16]。

1.3.2 TBA值測定

參考Wang Hua等[17]的方法。

1.3.3 DHA含量測定

[18-19]脂肪酸測定方法。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)各個(gè)因素水平值的設(shè)計(jì)是參考GB/T 2760—2011《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》及相關(guān)文獻(xiàn)[20]對各個(gè)添加劑使用限量的規(guī)定進(jìn)行，在國標(biāo)理論值范圍內(nèi)選取最優(yōu)抗氧化劑組合。依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取迷迭香粉、VE及VC棕櫚酸酯添加量3 個(gè)因素為試驗(yàn)因素，以POV、TBA值以及DHA含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案分別添加不同組合的抗氧化劑于藻油中，然后將各樣品置于60 ℃烘箱中加速氧化12 d后測定POV、TBA值和DHA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及回歸模型的建立

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table1 Results of response surface experimentsments

依據(jù)表1數(shù)據(jù)，用軟件 Design-Expert對以上結(jié)果回歸分析并建立回歸模型，得到各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的回歸方程如下：

Y1=37.27—100.35A—95.14B—54.64C＋37.67AB—38.00AC＋159.11BC＋142.63A2＋247.33B2＋137.56C2

Y2=2.04—6.56A—6.36B＋0.84C＋9.67AB—7.00AC—4.44BC＋8.75A2＋13.33B2＋2.67C2

Y3=—20.18＋178.69A＋178.58B＋96.95C—69.00AB＋129.67AC—258.67BC—268.75A2—501.33B2—320.00C2

2.2 回歸模型方差分析

表2 POV方差分析Table2 Variance analysis off PPOOVV

由表2可 知，POV模型回歸顯著（P＜0.05）且失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），R2為0.924 9，表明該方程擬合良好。在因素水平范圍內(nèi)，各因素對藻油POV的影響排序?yàn)椋篈＞C＞B。POV模型中A的一次項(xiàng)高度顯著，C的一次項(xiàng)顯著，A、B的二次項(xiàng)對POV的影響顯著，表明各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值并不是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對響應(yīng)值也有一定的關(guān)系。

表3 TBA值方差分析Table3 Variance analysis of TBA valuevalue

由表3可知，TBA值模型回歸顯著（P＜0.05）且失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），R2為0.914 6，說明該方程擬合良好。在因素水平范圍內(nèi)，各因素對藻油TBA值的影響排序?yàn)椋篈＞C＞B。TBA模型中A的一次項(xiàng)高度顯著，C的一次項(xiàng)顯著，A的二次項(xiàng)對TBA值影響顯著，表明各因素對響應(yīng)值并不是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對響應(yīng)值也有一定的關(guān)系。

表4 DHA含量方差分析Table4 Variance analysis of DHA contentntent

由表4可知，DHA含量模型回歸極顯著（P＜0.01）且失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），R2為0.950 0，顯示該方程擬合良好。在因素水平范圍內(nèi)，各因素對藻油響應(yīng)值的影響排序?yàn)椋篈＞C＞B。在DHA含量模型中A的一次項(xiàng)高度顯著，C的一次項(xiàng)顯著，A、B的二次項(xiàng)對DHA含量的影響高度顯著，C的二次項(xiàng)對響應(yīng)值影響顯著，表明各驗(yàn)因素對響應(yīng)值并不是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對響應(yīng)值也有一定的關(guān)系。因此，有必要探究兩因素間的交互作用。

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)各因素對響應(yīng)值所構(gòu)成的三維曲面圖，可直觀反映各個(gè)因素對其響應(yīng)值的影響，響應(yīng)圖中曲線越陡峭，則表明相對應(yīng)因素對響應(yīng)值的影響越大，響應(yīng)值變化越大[21]；響應(yīng)圖中等高線形狀也可以直觀反映出兩因素之間交互作用大小，等高線呈現(xiàn)橢圓形體現(xiàn)兩因素交互效應(yīng)顯著，而圓形則說明因素間交互作用較弱[22-23]，等高線和響應(yīng)面整體趨勢圖有一致性。各因素對POV、TBA值、DHA含量的影響見圖1～3。

圖1a、2a、3a顯示當(dāng)VC棕櫚酸酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，迷迭香粉和VE的加入量對POV、TBA值及DHA含量的交互影響。迷迭香質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，VE質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05‰～0.14‰之間時(shí)，POV、TBA值隨VE質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而下降，DHA含量隨其質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而升高，當(dāng)VE質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過0.14‰時(shí)，隨著VE質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，POV、TBA值呈升高趨勢，DHA含量呈下降趨勢；當(dāng)VE質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，迷迭香質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，POV、TBA值隨其下降，DHA含量增加，交互作用較為顯著。

圖1b、2b、3b顯示當(dāng)VE質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，迷迭香粉和VC棕櫚酸酯加入量對POV、TBA值及DHA含量的交互影響。VC棕櫚酸酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著迷迭香質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，POV、TBA值先下降后上升，DHA含量先升高后下降，變化趨勢相對比較平緩；當(dāng)迷迭香粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著VC棕櫚酸酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，POV、TBA值及DHA含量沒有明顯變化，說明兩因素間交互作用不顯著。

圖1c、2c、3c顯示當(dāng)迷迭香粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，迷迭香粉和VE的加入量對POV、TBA值及DHA含量的交互影響。VE質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著VC棕櫚酸酯質(zhì) 量分?jǐn)?shù)的增加，POV、TBA值下降，DHA含量升高，變化速率比較快，曲線陡峭；當(dāng)VC棕櫚酸酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，VE質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05‰～0.14‰?yún)^(qū)間時(shí)，POV、TBA值呈下降趨勢，DHA含量呈升高趨勢；當(dāng)VE質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.14‰時(shí)，隨著VC棕櫚酸酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，POV、TBA值隨其升高，DHA含量下降，交互作用顯著。

圖1～3直 觀地體現(xiàn)了各因子間的交互作用。從響應(yīng)面的極值點(diǎn)和等高線可以看出，在所取范圍內(nèi)存在極值，其是響應(yīng)面的最高點(diǎn)也是等高線橢圓的中心點(diǎn)。對圖1～3綜合分析可知，B（VE添加量）和C（VC棕櫚酸酯添加量）、A（迷迭香粉添加量）和B（V E添加量）兩組對應(yīng)的響應(yīng)曲面比較陡峭，且等高線呈扁平或橢圓狀，表明這兩組因素間的交互作用比較大；A（迷迭香粉添加量）和C（VC棕櫚酸酯添加量）兩因素在圖1和圖2對應(yīng)的響應(yīng)曲面相對比較平緩，圖中等高線傾向圓形形狀，雖圖3中對應(yīng)響應(yīng)曲面較為陡峭，但3 個(gè)模型綜合分析表明兩因素間的交互作用不大。

圖1 兩因素交互作用對POV影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of antioxidant combinations on POV

圖2 兩因素交互作用對TBA值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effect ofantioxidant combinations on TBA value

圖3 兩因素交互作用對DHA含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of antioxidant combinations on DHA content

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表5 響應(yīng)值優(yōu)化添加量Table5 Optimal antioxidant concentrations for response values

從表5可知，3 個(gè)響應(yīng)值取得最佳優(yōu)化結(jié)果時(shí)3 個(gè)影響因素添加量近似，表明3 個(gè)模型之間有一定相關(guān)性。為了檢測模型方程的可信度和適用性，對此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得最佳添加量為：迷迭香粉0.37‰、VE 0.11‰、VC棕櫚酸酯0.20‰，理論上得到的POV為9.03 meq/kg，TBA值為0.33 mg/kg，DHA含量為30.35%，實(shí)際測得POV為9.26 meq/kg，TBA值為0.35 mg/kg，DHA含量為30.17%，結(jié)果基本跟預(yù)測值保持一致，明顯優(yōu)于空白組（未添加任何添加劑）藻油穩(wěn)定性指標(biāo)：POV為23.95 meq/kg，TBA值為1.12 mg/kg，DHA含量為21.60%，說明該模型有一定實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對藻油中抗氧化劑添加量進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，建立了POV、TBA值和DHA含量與3 個(gè)抗氧化劑添加量的二次多項(xiàng)式回歸模型，且模型經(jīng)驗(yàn)證可靠合理。得到的最優(yōu)添加量組合為：迷迭香粉0.37‰、VE 0.11‰、VC棕櫚酸酯0.20‰，該優(yōu)化條件下藻油經(jīng)過12 d烘箱實(shí)驗(yàn)后測得過POV為9.26 meq/kg，TBA值為0.35 mg/kg，DHA含量為30.27%，有效延長了藻油貨架期。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化藻油中抗氧化劑組合穩(wěn)定可行，對生產(chǎn)實(shí)踐有一定的指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] SPOLAORE P JOANNIS-CASSAN C DURAN E et al Commercial applications of microalgae[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering′2006′101(2): 87-96．

[2] MENG Xin YANG Jianming XU Xin et al Biodiesel production from oleaginous microorganisms[J]. Renewable Energy′2009′34(1): 1-5.

[3] 楊賢慶′呂軍偉′林婉玲′等. DHA功能特性以及抗氧化性研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技′2014′35(2): 390-392.

[4] 曹萬新′孟橘′田玉霞. DHA的生理功能及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國油脂′2001′36(3): 1-3.

[5] 代榮陽′陳潤′周志遠(yuǎn)′等. DHA和EPA的抗炎及免疫調(diào)節(jié)功能[J]. 瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)′2004′2(1): 83-84.

[6] 張春艷. DHA和EPA的生理作用及開發(fā)利用研究進(jìn)展[J]. 柳州師專學(xué)報(bào)′2005′20(3): 118-121.

[7] SONG J KWON N LEE M H et al Association of serum phospholipid PUFAs with cardiometabolic risk beneficial effect of DHA on the suppression of vascularproliferation/inflammation[J]. Clinical Biochemistry′2014′47(6): 361-368.

[8] WELLEN K E HOTAMISLIGIL G S Inflammation stress and diabetes[J]. Journal of Clinical Investigation′2005′115(5): 1111-1119. [9] BLOCK R C HARRIS W S REID K J et al EPA and DHA in blood cell membranes from acute coronary syndrome patients and controls[J]. Atherosclerosis′2008′197(2): 821-828.

[10] KOMPRDA T Eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids as inflammation-modulating and lipid homeostasis influencing nutraceuticals a review[J]. Journal of Functional Foods′2012′4(1): 25-38.

[11] WHYSNER J WANG C X ZANG E et al Dose response of promotion by butylated hydroxyanisole in chemically initiated tumours of the rat forestomach[J]. Food Chemical Toxicology′1994′32(3): 215-222.

[12] 陸洋′楊波濤′陳鳳香. 復(fù)配天然抗氧化劑對食用油脂抗氧化效果研究[J]. 食品科學(xué)′2009′30(11): 55-57.

[13] ZDUNCZYK Z FREJNAGEL S WROBLEWSKA M et al Biologicalactivity of polyphenol extracts from different plant sources[J]. Food Research International′2002′35(2/3): 183-186.

[14] 周正′侯建軍′楊菊芳′等. 幾種抗氧化劑對亞麻油穩(wěn)定性的影響[J]. 食品科學(xué)′2 014′35(5): 75-80. doi:10.7506/spkx1002-6630-201405015.

[15] 陳振林′熊華′齊金鋒′等. 抗氧化劑對米糠油貯存穩(wěn)定性的影響[J]. 中國油脂′2008′33(11): 31-34.

[16] GB/T 5009.37—2003 食物植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法[S].

[17] WANG Hua LIU Fang YANG Lei et al Oxidative stability of fish oil supplemented with carnosic acid compared with synthetic antioxidants during long-term storage[J]. Food Chemistry′2011′128(1): 93-99.

[18] 葉鴿′郝淑賢′李來好′等. 不同養(yǎng)殖模式羅非魚品質(zhì)的比較[J]. 食品科學(xué)′2014′35(2): 196-200. doi:10.7506/spkx1002-6630-201402037.

[19] 李來好′葉鴿′郝淑賢′等. 2種養(yǎng)殖模式羅非魚品質(zhì)的比較[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)′2013′9(5): 1-6.

[20] GB/T 2760—2011 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].

[21] 吳現(xiàn)芳′趙成愛′余梅燕′等. 響應(yīng)面法優(yōu)化八寶景天葉總黃酮的超聲提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技′2013′34(1): 224-228.

[22] 呂長鑫′李萌萌′徐曉明′等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化纖維素酶提取紫蘇多糖工藝[J]. 食品科學(xué)′2013′34(2): 259-263.

[23] 胡婷婷′王茵′吳成業(yè). 響應(yīng)面法優(yōu)化蝦青素微膠囊制備工藝[J]. 食品科學(xué)′2014′35(12): 53-59. doi:10.7506/spkx1002-6630-201412010.

Optimization of Antioxidant Combinations for Algal Oil by Response Surface Methodology

L Junwei1′2′YANG Xianqing1′*′LIN Wanling1′LI Laihao1′MA Haixia1′WEI Ya1
(1. Key Laboratory of Aquatic Product Processing Ministry of Agriculture National Research and Development Center for Aquatic Product Processing South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences Guangzhou 510300′China; 2. College of Food Science and Technology Shanghai Ocean University Shanghai 201306′China)

The concentrations of rosemary powder (containing 30% or more carnosic acid)′VE and VC added together to algal oil for improved oxidative stability were optimized using Box-Behnken experimental design combined with response surface analysis based on peroxide value (POV)′thiobarbituric acid (TBA value and docosahexaenoic acid (DHA content A quadratic regression model was established The optimal combination of the three antioxidants was 0.37‰ rosemary spices′0.11‰ VE and 0.20‰ VC palmitate The POV value was 9.26 meq/kg TB A value 0.35 mg/kg and DH A content 30.27% under the optimized conditions after 12 day of accelerated oven-oxidation test A good agreement was observed between the predicted and actual values indicating that the established model in this study is feasible.

algal oil antioxidants response surface methodology

TS254.1

A

1002-6630（2015）06-0091-05

10.7506/spkx1002-6630-201506017

2014-07-11

海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項(xiàng)（GD2012-A01）；國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201005020）

呂軍偉（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。E-mail：389399231@qq.com

*通信作者：楊賢慶（1963—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。E-mail：yxqgd@163.com