馬 娜，申婷婷，趙 江，王佳楠，張澤生，王 浩，*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；3.南開大學(xué)濱海學(xué)院，天津 300270）

黑米通過上調(diào)小腸ABCG5/8和ABCA1基因表達(dá)降低膽固醇水平

馬 娜1，2，申婷婷2，趙 江1，王佳楠3，張澤生1，王 浩1，*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；3.南開大學(xué)濱海學(xué)院，天津 300270）

以高脂膳食飼喂致高膽固醇小鼠為動物模型，研究黑米對小鼠血脂水平及小腸膽固醇代謝相關(guān)基因調(diào)控的影響。將48 只雄性C57BL/6J小鼠隨機分成高脂對照組和3 個實驗組（白米組、黑米低劑量組、黑米高劑量組），測定血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）及高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平，氣相色譜法檢測肝臟中膽固醇含量，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）分析調(diào)控小腸膽固醇合成、吸收、轉(zhuǎn)化及排泄基因HMG-CoA-R、MTP、ABCG5/8、ABCA1、NPC1L1等的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明：與高脂對照組相比，白米組小鼠血清中TC、TG、HDL-C含量無統(tǒng)計學(xué)差異，但黑米低、高劑量組小鼠血清中TC和TG含量降低，且HDL-C含量顯著或極顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與高脂對照組相比，白米組小鼠肝臟中膽固醇含量無顯著變化，黑米低劑量組顯著降低（P＜0.05），黑米高劑量組極顯著降低（P＜0.01）。Real-time PCR結(jié)果顯示，與高脂對照組相比，黑米低、高劑量組ABCG5/8、ABCA1 mRNA表達(dá)水平均極顯著上調(diào)（P＜0.01）；黑米低劑量組NPC1L1 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05），黑米高劑量組極顯著降低（P＜0.01）。黑米對高脂膳食飼喂致高膽固醇小鼠膽固醇代謝平衡的調(diào)節(jié)可能是通過增加小腸中膽固醇的排泄并抑制其吸收實現(xiàn)的。

黑米；小鼠；ABCG5/8；ABCA1；NPC1L1

心腦血管疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的頭號大敵[1]，高血脂癥是引起心腦血管疾病的一個主要原因。因此，通過日常飲食調(diào)節(jié)對預(yù)防和治療心腦血管疾病具有重要意義。

黑米富含花色苷，研究顯示膳食給予黑米花色苷或黑米皮提取物能夠調(diào)控機體氧化應(yīng)激平衡、血脂代謝、炎癥水平等[2-5]。Ling Wenhua等[6-7]報道了膳食黑米和黑米皮不僅可以降低實驗動物的血脂水平、抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，還可以降低機體氧化應(yīng)激水平和提高抗氧化酶活性，并推測該作用與其花色苷類物質(zhì)有關(guān)。

因此，本實驗以高脂喂飼致高膽固醇血癥雄性C57BL/6J小鼠為模型，以添加白米為對照組，研究黑米對小鼠血脂水平及小腸膽固醇代謝相關(guān)基因調(diào)控的影響，并對其機理進(jìn)行初步探討，以期為居民健康膳食提供科學(xué)指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

黑米（碳水化合物含量78.7%、蛋白質(zhì)含量9.8%、脂肪含量2.9%、花青素含量1.4%）、白米（碳水化合物含量79.1%、蛋白質(zhì)含量9.5%、脂肪含量1.1%） 市售。

三甲基硅烷（trimethylsilane，TMS） 美國Supelco公司；TRIzol、SYBR Premix Ex TaqⅡ、cDNA合成試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Fresco17/21冷凍離心機 美國Thermo公司；UVmini-1240紫外-可見分光光度計 日本島津公司；iCycler實時定量PCR儀、GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀 美國Bio-Rad公司；安捷倫7890A氣相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與飼養(yǎng)

將48 只清潔級雄性C57BL/6J小鼠飼喂普通飼料適應(yīng)1 周后，根據(jù)體質(zhì)量隨機分成4 組，每組12只，自由攝食飲水。鼠糧配方見表1。記錄小鼠的進(jìn)食量以及體質(zhì)量。8 周后斷頸處死小鼠，眼眶取血，離心分離血清，—20 ℃保存待測；分離小鼠內(nèi)臟，稱質(zhì)量，—80 ℃保存。

表1 鼠糧成分組成及含量Table 1 Composition and ingredients of the control diet and three experimental diieettssg/kg

1.3.2 小鼠血清血脂水平測定

參照試劑盒說明書提供的方法測定小鼠血清總膽固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白膽固醇含量。

1.3.3 肝臟膽固醇含量測定

采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）進(jìn)行肝臟組織中膽固醇含量的測定，具體參見實驗室之前發(fā)表論文的方法[8]：肝臟組織經(jīng)氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）勻漿后提取不皂化物，N2吹干，TMS衍生化，以豆甾醇為內(nèi)標(biāo)利用GC檢測。

1.3.4 小腸膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平測定

Trizol法從腸組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃，終止）。取上述產(chǎn)物進(jìn)行Real-time PCR擴增（95 ℃預(yù)變性30 s；PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；溶解步驟），以GAPDH為內(nèi)參基因。GAPDH：上游5’-G C C T T C C G T G T T C C T A C C-3’，下游5’-CTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’；HMG-CoA-R：上游5’-CCAATGGCAACAACGGAAGG-3’，下游5’-GAATCACAAGCACGAGGAAGAC-3’；ABCA1：上游5’-CAGAAGTTGGATGGATTAGATTGG-3’，下游5’-T T G C C T G G T T G G T C T C A T T G-3’；ABCG5：上游5’-GTTCCAAGACTGCTTCTC-3’，下游5’- ATGACTGCCTCTACCTTC-3’；ABCG8：上游5’-TTGGACAACCTGTGGATAG-3’，下游5’-ATAGAGTGGATGCGAGTTC-3’；MTP：上游5’-GCCACATCTGTCACTACCTAC-3’，下游5’-CACCTGCCACTTGCTTCC-3’；NPC1L1：上游5’-CCAACAGGAACAAGAACAAG-3’，下游5’-GACAAGGCTATCACAACTATG-3’。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米對小鼠血脂水平的影響

圖1 小鼠血清中TC、TG、HDL-C含量的變化Fig.1 Changes in serum TC， TG and HDL-C in mice fed with control diet and three experimental diets

由圖1可知，經(jīng)過8 周喂養(yǎng)，與高脂對照組和白米組相比，黑米低、高劑量組小鼠血清中的TC、TG含量有降低趨勢（P＞0.05）；與高脂對照組相比，黑米低劑量組HDL-C含量顯著升高（P＜0.05），黑米高劑量組HDL-C含量極顯著升高（P＜0.01）。

黑米富含花色苷，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，富含花色苷的食物或者食物提取物對于血脂異常有明顯的改善作用，花色苷對血脂的調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)在降低TC、TG水平，提高HDL-C水平方面[9]。Xia Min[10]和Ling Wenhua[6-7]等研究發(fā)現(xiàn)黑米或黑米皮可以升高載脂蛋白E基因敲除小鼠和兔子HDL-C水平，從而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生。本實驗中黑米低、高劑量組小鼠體內(nèi)HDL-C含量明顯升高（P＜0.05），這與上述文獻(xiàn)[6-7，10]的研究結(jié)果一致。

2.2 黑米對小鼠肝臟膽固醇含量的影響

圖2 小鼠肝臟中膽固醇含量的變化Fig.2 Changes in hepatic cholesterol levels in mice fed with control diet and three experimental diets

由圖2可知，與高脂對照組相比，白米組小鼠肝臟中膽固醇含量沒有顯著變化，黑米低劑量組小鼠肝臟中膽固醇含量顯著降低（P＜0.05），黑米高劑量組極顯著降低（P＜0.01）。

2.3 黑米對小鼠小腸中HMG-CoA-R、NPC1L1、ABCG5/8、ABCA1、MTP mRNA表達(dá)的影響

圖3 黑米對高脂小鼠小腸HHMMGG-CCooAA-R、NPPCC11LL11、AABBCCAA11、AABBCCGG55/8和MMTTPP mRNA表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of three experimental diets added with white rice or black rice at various dosages on mRNA levels of HMG-CoA-R， NPC1L1，ABCA1， ABCG5/8 and MTP in mice fed with a high fat and high cholesterol diet

三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）作為介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇流出的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運體，具有介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)流出，維持細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的功能，對防止動脈粥樣硬化形成具有重要意義[11-12]。ABCA1的功能是將細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，再經(jīng)HDL運送至肝臟代謝形成膽汁酸，從而完成膽固醇代謝。ABCA1途徑在膽固醇流出中有重要地位，研究顯示，過表達(dá)ABCA1可以明顯抑制動脈粥樣硬化病變的進(jìn)程[13]。ABCG5/8（ATP binding cassette transporter subfamily G members 5/8）能夠限制膽固醇在小腸中的吸收，同時把膽固醇排向腸腔。最近的研究表明，ABCG8基因多態(tài)性與膽固醇吸收有關(guān)，影響膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)[14]。Yu Liqing等[15]研究表明，膽固醇飲食可誘導(dǎo)腸內(nèi)ABCG5和ABCG8的表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果顯示，與高脂對照組相比，給予黑米膳食可極顯著上調(diào)小鼠小腸內(nèi)ABCA1、ABCG5/8 mRNA的表達(dá)（P＜0.01）；NPC1L1（Niemann-pick C1-like 1）蛋白在哺乳動物小腸中大量表達(dá)[16]，主要介導(dǎo)小腸從飲食和膽汁中吸收游離的膽固醇進(jìn)入腸黏膜[17-18]。Altmann等[16]研究發(fā)現(xiàn)NPC1L1基因敲除小鼠腸膽固醇吸收水平下降72%。本實驗結(jié)果顯示，與高脂對照組相比，黑米低、高劑量組NPC1L1 mRNA表達(dá)水平均顯著或極顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），表明小腸中游離膽固醇的吸收極有可能減少；小腸和肝臟是體內(nèi)膽固醇內(nèi)源合成的主要器官，細(xì)胞通過HMG-CoA還原酶（HMG-CoA-R）催化合成膽固醇，這是膽固醇合成的限速步驟[19-20]，體內(nèi)研究表明，膽固醇能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)HMG-CoA-R，不同動物的調(diào)節(jié)方式可能不同，大鼠主要在翻譯水平調(diào)節(jié)，而倉鼠和小鼠則表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上[21-22]，PCR結(jié)果顯示，與高脂對照組相比，小腸HMG-CoA-R mRNA表達(dá)有下降趨勢（P＞0.05）；微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運蛋白（microsomal triglycerol transfer protein，MTP）主要參與新合成的載脂蛋白脂化形成新的脂蛋白顆粒[23]，并將合成的脂蛋白轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外[24]。結(jié)果顯示，與高脂對照組相比，MTP mRNA表達(dá)有下降趨勢（P＞0.05）。

3 結(jié) 論

膽固醇代謝平衡主要包括以下三方面：膽固醇（食物或膽汁中）的吸收，內(nèi)源膽固醇的從頭合成以及膽固醇的轉(zhuǎn)化和外排[25]。膽固醇的吸收主要發(fā)生在小腸內(nèi)，腸道中吸收的膽固醇主要來自于食物、膽汁等，經(jīng)過小腸的膽固醇約有50%被吸收。本實驗結(jié)果表明：與高脂對照組相比，給予黑米膳食后小鼠體內(nèi)NPC1L1 mRNA表達(dá)水平顯著或極顯著降低，ABCA1和ABCG5/8 mRNA表達(dá)水平極顯著升高，故黑米對高脂膳食飼喂致高膽固醇小鼠膽固醇代謝平衡的調(diào)節(jié)，可能是通過增加小腸中膽固醇的排泄并抑制其吸收實現(xiàn)的。

[1] 楊曉倩， 張霽月， 周小莉， 等. 幾種谷物在心血管疾病方面的作用[J].中國心血管病研究雜志， 2008， 6(10): 787-789.

[2] ZAWISTOWSKI J， KOPEC A， KITTS D D. Effects of a black rice extract (Oryza sativa L. indica) on cholesterol levels and plasma lipid parameters in Wistar Kyoto rats[J]. Journal of Functional Foods， 2009，1(1): 50-56.

[3] MIDDLETON E， KANDASWAMI C， THEOHARIDES T C. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation， heart disease， and cancer[J]. Pharmacological Reviews，2000， 52(4): 673-751.

[4] JANG Meishi， CAI Lining， UDEANI G O， et al. Cancer chemopreventive activity of resveratrol， a natural product derived from grapes[J]. Science， 1997， 275: 218-220.

[5] CHE N Peini， KUO W H， CHIANG C L， et al. Black rice anthocyanins inhibit cancer cells invasion via repressions of MMPs and u-PA expression[J]. Chemico-Biological Interactions， 2006， 163(3): 218-229.

[6] LING Wenhua， CHENG Qixuan， MA Jing， et al. Red and black rice decrease atherosclerotic plaque formation and increase antioxidant status in rabbits[J]. The Journal of Nutrition， 2001， 131(5): 1421-1426.

[7] LING Wen hua， WANG Linlin， MA Jing. Supplementation of the black rice outer layer fraction to rabbits decreases atherosclerotic plaque formation and increases antioxidant status[J]. The Journal of Nutrition，2002， 132(1): 20-26.

[8] WANG Hao， ZHANG Zesheng， GUO Ying， et al. Hawthorn fruit increases the antioxidant capacity and reduces lipid peroxidation in senescence-accelerated mice[J]. European Food Research and Technology， 2011， 232(5): 743-751.

[9] KOWALCZYK E， KRZESI?SKI P， KURA M， et al. Anthocyanins in medicine[J]. Polish Journal of Pharmacology， 2003， 55(5): 699-702.

[10] XIA Min， LING Wenhua， MA Jing， et al. Supplementation of diets with the black rice pigment fraction attenuates atherosclerotic plaque formation in apolipoprotein E deficient mice[J]. The Journal of Nutrition， 2003， 133(3): 744-751.

[11] VAUGHAN A M， ORAM J F. ABCA1 and ABCG1 or ABCG4 act sequentially to remove cellular cholesterol and generate cholesterolrich HDL[J]. Journal of Lipid Research， 2006， 47(11): 2433-2443.

[12] 路倩， 陳五軍， 尹凱， 等. 動脈粥樣硬化中膽固醇外流的研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2012， 39(4): 319-326.

[13] van ECK M， SINGARAJA R R， YE D， et al. Macrophage ATP-binding cassette transporter A1 overexpression inhibits atherosclerotic lesion progression in low-density lipoprotein receptor knockout mice[J]. Arteriosclerosis， Thrombosis， and Vascular Biology， 2006，26(4): 929-934.

[14] MATSUO M. ATP-binding cassette proteins involved in glucose and lipid homeostasis[J]. Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry，2010， 74(5): 899-907.

[15] YU Liqing， LI-HAWKINS J， HAMMER R E， et al. Overexpression of ABCG5 and ABCG8 promotes biliary cholesterol secretion and reduces fractional absorption of dietary cholesterol[J]. The Journal of Clinical Investigation， 2002， 110(5): 671-680.

[16] ALTMANN S W， DAVIS H R， ZHU Liji， et al. Niemann-pick C1 like 1 protein is critical for intestinal cholesterol absorption[J]. Science， 2004， 303: 1201-1204.

[17] TEMEL R E， TANG Weiqing， MA Yinyan， et al. Hepatic Niemannpick C1-like 1 regulates biliary cholesterol concentration and is a target of ezetimibe[J]. Journal of Clinical Investigation， 2007， 117(7): 1968-1978.

[18] DAVIS H R， ALTMANN S W. Niemann-pick C1 like 1 (NPC1L1) an intestinal sterol transporter[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids， 2009， 1791(7): 679-683.

[19] GOLDSTEIN J L， BROWN M S. Regulation of the mevalonate pathway[J]. Nature， 1990， 343: 425-430.

[20] BROWN M S， DANA S E， GOLDSTEIN J L. Regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase activity in human fibroblasts by lipoproteins[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1973， 70(7): 2162-2166.

[21] CHAMBERS C M， NESS G C. Dietary cholesterol regulates hepatic 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene expression in rats primarily at the level of translation[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics， 1998， 354(2): 317-322.

[22] SHIMOMURA I， BASHMAKOV Y， SHIMANO H， et al. Cholesterol feeding reduces nuclear forms of sterol regulatory element binding proteins in hamster liver[J]. Proceedings of the National Academy of Science s， 1997， 94(23): 12354-12359.

[23] KULINSKI A， RUSTAEUS S， VANCE J E. Microsomal triacylglycerol transfer protein is required for lumenal accretion of tr iacy lglycerol not associated with ApoB， as well as for ApoB lipidation[J]. Journal of Biological Chemistry， 2002， 277(35): 31516-31525.

[24] BORRADAILE N M， de DREU L E， BARRETT P H R， et al. Inhibition of hepatocyte ApoB secretion by naringenin enhanced rapid intracellular degradation independent of reduced microsomal cholesteryl esters[J]. Journal of Lipid Research， 2002， 43(9): 1544-1554.

[25] DIETSCHY J M， TURLEY S D， SPADY D K. Role of liver in the maintenance of cholesterol and low density lipoprotein homeostasis in different animal species， including humans[J]. Journal of Lipid Research， 1993， 34(10): 1637-1659.

Black Rice Reduces Cholesterol Level by Upregulating ABCG5/8 and ABCA1 mRNA Expression in Intestines

MA Na1，2， SHEN Tingting2， ZHAO Jiang1， WANG Jianan3， ZHANG Zesheng1， WANG Hao1，*
(1. School of Food Engineering and Biological Technology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China; 2. College of Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China; 3. Binhai College， Nankai University， Tianjin 300270， China)

The influence of black rice on serum lipid (TC， TG， HDL-C) levels and the expression of intestinal cholesterol metabolism-related genes (HMG-CoA-R， MTP， ABCG5/8， ABCA1 and NPC1L1) induced by high fat and high cholesterol diet (HFHC) was investigated in mice. Male mice (n = 48) were divided into four groups. They were fed a HFHC diet alone (C group， n = 12)， or supplemented with 52.6 g/100 g corn starch or with white rice (C+W group， n = 12)，26.3 g/100 g black rice (C+BL group， n = 12) or 52.6 g/100 g black rice (C+BH group， n = 12). After administration for 8 weeks， blood samples were collected for lipid measurements and viscera were removed at the end of the protocol. Serum total cholesterol (TC)， triglyceride (TG) and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) were assayed by commercial kits. Gas chromatography (GC) was used to determine cholesterol content in hepatic cells. The mRNA expression levels of intestinal HMG-CoA-R， MTP， ABCG5/8， ABCA1 and NPC1L1 were detected by real-time PCR. The contents of serum TC，TG and HDL-C in the experimental groups were similar with those of the control group. However， HDL-C in the black rice groups was significantly elevated when compared with that of the control group (P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01). Hepatic cholesterol content were significantly decreased in the C + BL（P ＜ 0.05）and C + BH（P ＜ 0.01）groups when compared with that of the C group. The mRNA expression levels of ABCG5/8 and ABCA1 in intestines were up-regulated by dietary back rice(P ＜ 0.01) when compared with those of the C group. The expression level of NPC1L1 mRNA was downregulated in the C + BL (P ＜ 0.05) and C + BH (P ＜ 0.01) groups. The increase of cholesterol excretion and the inhibition of cholesterol absorption in intestines may explain the mechanisms underlying the hypolipidemic effect of black rice.

black rice; mice; ABCG5/8; ABCA1; NPC1L1

TS201.4

A

1002-6630（2015）09-0136-05

10.7506/spkx1002-6630-201509025

2014-06-11

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31201322）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B05）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計劃項目（20100609）；天津科技大學(xué)大學(xué)生實驗室創(chuàng)新基金項目（1314A216）

馬娜（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)學(xué)。E-mail：nana1191086372@163.com

*通信作者：王浩（1979—），男，副教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與健康。E-mail：wanghao@tust.edu.cn