鄭鴻雁，趙煒彤，昌妍希

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100）

響應(yīng)面法優(yōu)化假絲酵母Y6產(chǎn)γ-氨基丁酸發(fā)酵工藝

鄭鴻雁1，趙煒彤1，昌妍希2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100）

從火龍果果實表面上篩選出一株發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）假絲酵母菌菌株Y6（Candida sp.）。用反相高效液相色譜測定發(fā)酵液中GABA含量。響應(yīng)面試驗確定其最適培養(yǎng)基成分為：蔗糖23 g/L、麩皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L。最適培養(yǎng)條件為初始 pH 4.5、培養(yǎng)溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、培養(yǎng)時間3.5 d。結(jié)果表明：優(yōu)化之后GABA的產(chǎn)量提高了72%。

γ-氨基丁酸；假絲酵母；響應(yīng)面法；培養(yǎng)基成分

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又稱氨酪酸，是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，分布非常廣泛[1]，在動物[2]、植物和微生物中均有γ-氨基丁酸存在[3-6]。GABA是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[7]，具有許多重要的生理功能，如降血壓[8]、安定神經(jīng)[9]、增強記憶[10]、抗焦慮[11]，尤其對更年期的失眠、壓抑和自身失調(diào)療效良好[12]。隨著GABA的生理功能不斷研究和闡明[13]，已經(jīng)發(fā)展成為一種新型的功能性因子[14]，正逐漸應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及農(nóng)業(yè)等行業(yè)中[15-17]。目前GABA主要通過微生物發(fā)酵方法進行生產(chǎn)[18]，大腸桿菌是發(fā)現(xiàn)較早的具有谷氨酸脫羧酶活性的微生物，利用大腸桿菌發(fā)酵法制備的GABA一般用于化工生產(chǎn)，很少用于食品工業(yè)，因此制約了GABA的生產(chǎn)和開發(fā)[19]。本研究以篩選自火龍果果實表面的假絲酵母菌株Y6為研究對象，通過單因素試驗和響應(yīng)面法對其產(chǎn)GABA進行發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，提高GABA產(chǎn)量。用麩皮作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，為規(guī)?；昧畠r農(nóng)副產(chǎn)品生產(chǎn)保健品奠定了基礎(chǔ)，對于GABA的發(fā)酵生產(chǎn)具有參考意義?？傊?，國內(nèi)學(xué)者的研究工作主要集中在篩選高產(chǎn)GABA的菌株上，但是其規(guī)?；a(chǎn)的成本太高，因此降低γ-氨基丁酸的發(fā)酵培養(yǎng)成本是限制我國生產(chǎn)γ-氨基丁酸的瓶頸問題，突破該瓶頸勢在必行。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

假絲酵母（Candida sp.）Y6：分離自火龍果果實表面，購于長春市歐亞超市。菌種經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司分子生物學(xué)鑒定。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g、麩皮40 g、L-谷氨酸5 g、磷酸吡哆醛0.12 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL。

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品 上?？笊锛夹g(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Z-36HK高速低溫冷凍離心機 德國Hermle公司；DL-CJ-2N超級潔凈工作臺、空氣浴振蕩箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀（SPD-20A紫外檢測器，LC-20AT泵，CTO-10AS VP柱溫箱，LC-solution工作站） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株Y6發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)條件

按2%的接種量接種在裝有100 mL無菌發(fā)酵培養(yǎng)基（初始pH 6.0）的250 mL三角瓶中，26 ℃、200 r/min條件下恒溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2.0 d。

1.3.2 GABA含量的測定

用鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）柱前衍生紫外檢測反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法測定發(fā)酵液中GABA含量。液相色譜條件：色譜柱：Venusil-AA氨基酸分析專用柱（5 μm）。流動相：流動相A為25 mmol/L的乙酸鈉，用4%的乙酸調(diào)pH值至5.9；流動相B為純乙腈。流速為1 mL/min，梯度洗脫程序如表1所示，柱溫40 ℃，進樣量20 μL，檢測波長：332 nm。取發(fā)酵液5 000 r/min離心15 min取上清液，稀釋到一定濃度。發(fā)酵液20 μL于樣品瓶中，加入OPA衍生液100 μL，渦旋振蕩5 s，靜置2 min后，過0.45 μm濾膜，取20 μL進樣。定量采用GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線，取0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別鄰苯二甲醛衍生后進行液相色譜測定。以色譜圖中峰面積為縱坐標(biāo)，以待測樣品質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=8.9×107x＋1 155.9（R2=0.999 8）。采用RP-HPLC檢測GABA所得的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成GABA產(chǎn)量。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗

選擇不同碳源、碳源質(zhì)量濃度、麩皮添加量、L-谷氨酸和磷酸吡哆醛作為影響假絲酵母Y6產(chǎn)GABA發(fā)酵培養(yǎng)基的主要因素。不同碳源種類有葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖（30 g/L)，選取最適碳源進行發(fā)酵試驗。各因素的水平梯度設(shè)置分別為最適碳源質(zhì)量濃度15、20、25、30、35 g/L，麩皮添加量40、50、65、70、80 g/L，L-谷氨酸3、4、5、6、7、8、9 g/L，磷酸吡哆醛0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L。

1.3.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取蔗糖質(zhì)量濃度、麩皮添加量、L-谷氨酸添加量、磷酸吡哆醛添加量4 個因素為自變量，單因素試驗得出的各最佳條件為中心點，以GABA為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)培養(yǎng)基組分含量。每個試驗重復(fù)3 次，取其平均值。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗

選擇初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間作為影響假絲酵母Y6產(chǎn)GABA發(fā)酵條件的主要因素，通過單因素試驗結(jié)果選取響應(yīng)面試驗的因素和水平。各因素的水平梯度設(shè)置分別為時間2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 d，溫度22、24、26、28、30、32、34 ℃，初始pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，搖床轉(zhuǎn)速120、140、160、180、200、220 r/min。

1.3.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間4 個因素為自變量，單因素試驗得出的各最佳條件為中心點，以GABA為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，確定最優(yōu)發(fā)酵條件。每個試驗重復(fù)3 次，取其平均值。

1.3.5 模型驗證

通過響應(yīng)面法優(yōu)化假絲酵母菌Y6產(chǎn)GABA發(fā)酵條件進行發(fā)酵試驗，比較模型預(yù)測值和試驗值，驗證模型的有效性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert 7.0軟件設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面分析試驗，試驗結(jié)果采用Design Expert 7.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，確定最佳試驗條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.1.1 培養(yǎng)基單因素試驗結(jié)果

圖1 培養(yǎng)基對GABA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of medium components on GABA production

由圖1a可知，不同的碳源種類對GABA產(chǎn)量有差異，以蔗糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源時，GABA產(chǎn)量明顯高于其他碳源，所以把蔗糖選作最適碳源。在確定碳源種類的基礎(chǔ)上，進一步確定蔗糖質(zhì)量濃度大小，由圖1b可知，隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增大，GABA產(chǎn)量增加，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為25 g/L時，GABA產(chǎn)量達到最大。但隨著蔗糖質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，GABA產(chǎn)量降低，分析原因有可能是碳源質(zhì)量濃度過大，會使菌體大量繁殖，影響GABA的積累。L-谷氨酸脫羧后生成GABA，可作為其前體物，由圖1c可知，隨著L-谷氨酸的增加，GABA產(chǎn)量迅速增大，當(dāng)L-谷氨酸質(zhì)量濃度為6 g/L時，GABA產(chǎn)量達到3.100 g/L，但繼續(xù)增加L-谷氨酸，GABA產(chǎn)量沒有明顯增大，可能是因為L-谷氨酸轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達到最大。麩皮是廉價農(nóng)副產(chǎn)品，把它作為培養(yǎng)基的氮源，可以降低成產(chǎn)成本，增大麩皮的利用價值，由圖1d可知，隨著麩皮添加量的增大，GABA產(chǎn)量增加，麩皮添加量在60 g/L時，GABA產(chǎn)量最高，在麩皮超過60 g/L時，GABA產(chǎn)量略有降低，磷酸吡哆醛是谷氨酸脫羧酶的輔酶，在發(fā)酵培養(yǎng)基加入它有促進谷氨酸脫羧酶的作用，由圖1e可知，磷酸吡哆醛的最佳濃度為0.5 mmol/L。

2.1.2 培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface central composite design and experimental results for the optimization of medium components

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model for medium components

由方差分析得出P值，模型極顯著，模型的失擬項不顯著，回歸決定系數(shù)R2=0.950 4，修正決定系數(shù)= 0.900 7，說明方程擬合性較好，可以應(yīng)用于對培養(yǎng)基優(yōu)化的分析預(yù)測。根據(jù)結(jié)果進行分析：一次項X1、X4顯著，X2極顯著，二次項極顯著，交叉項X1X2顯著，X1X4、X2X3極顯著。由表3可知，影響GABA產(chǎn)量的因素大小排序依次是麩皮質(zhì)量濃度、蔗糖質(zhì)量濃度、磷酸吡哆醛濃度、L-谷氨酸質(zhì)量濃度。

圖2 培養(yǎng)基交互因素響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of medium components on GABA production

發(fā)酵培養(yǎng)基交互因素響應(yīng)面立體分析見圖2。數(shù)據(jù)分析表明回歸模型存在最大值，發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)配方為：蔗糖23 g/L、麩皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L，此條件下理論預(yù)測最大值為3.453 g/L。驗證實驗此條件下GABA產(chǎn)量為3.450 g/L，基本與預(yù)測值一致，證明了模型的可靠性。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)最適條件的確定

2.2.1 發(fā)酵條件單因素試驗結(jié)果

圖3 發(fā)酵培養(yǎng)條件對GABA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation conditions on GABA production

由圖3a可知，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值在4.0～5.0的范圍內(nèi)，GABA產(chǎn)量在增大，當(dāng)pH值大于5.0時，GABA產(chǎn)量明顯下降，表明培養(yǎng)假絲酵母Y6的最適pH值在5.0附近。由圖3b可知，溫度為28 ℃，GABA產(chǎn)量最高，低于或高于28 ℃，都不利于菌株產(chǎn)GABA，說明28 ℃左右是假絲酵母Y6產(chǎn)GABA較為適宜的溫度。由圖3c可知，搖床轉(zhuǎn)速從120 r/min增加到200 r/min的過程中，GABA產(chǎn)量不斷增大，在轉(zhuǎn)速高達220 r/min時，GABA產(chǎn)量略有降低。由圖3d可知，在發(fā)酵時間為2.0 d時，GABA產(chǎn)量為2.500 g/L，隨著發(fā)酵時間的延長，GABA產(chǎn)量逐漸增加。發(fā)酵時間在3.5 d時達最高，為4.100 g/L。但多于3.5 d時，GABA產(chǎn)量略有減少，選擇3.5 d為發(fā)酵培養(yǎng)時間。

2.2.2 發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化

表4 發(fā)酵條件響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Response surface central composite design and experimental results for the optimization of fermentation conditions

表5 發(fā)酵條件回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model for fermentation conditions

試驗方案及試驗結(jié)果見表4，回歸分析見表5。根據(jù)試驗結(jié)果，利用響應(yīng)面分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析，以GABA產(chǎn)量為響應(yīng)值，得到回歸方程表達為：

由方差分析得出P值，模型極顯著，模型的失擬性不顯著，回歸決定系數(shù)R2=0.955 9，修正決定系數(shù)說明方程擬合性較好，可以應(yīng)用于對發(fā)酵條件優(yōu)化的分析預(yù)測。根據(jù)結(jié)果進行分析：一次項X1極顯著，二次項極顯著，交叉項極顯著。由表5可知，影響GABA產(chǎn)量的因素由大到小排序依次是初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間。

圖4 發(fā)酵條件交互因素響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of fermentation conditions on GABA production

發(fā)酵條件交互因素響應(yīng)面立體分析見圖4。數(shù)據(jù)分析表明回歸模型存在最大值，發(fā)酵最優(yōu)條件為：初始pH 4.5、培養(yǎng)溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、培養(yǎng)時間3.5 d，此條件下理論預(yù)測最大值為4.333 g/L。進行驗證實驗，此條件下GABA產(chǎn)量為4.300 g/L，基本與預(yù)測值一致。

與采用其他氮源發(fā)酵生產(chǎn)GABA相比，利用麩皮作為氮源突破發(fā)酵成本高的缺陷，降低其生產(chǎn)成本，增加麩皮及農(nóng)副產(chǎn)品的附加值，實現(xiàn)農(nóng)副產(chǎn)品環(huán)境友好的高附加值轉(zhuǎn)化，在實際應(yīng)用中具有更加廣闊的發(fā)展空間。除酵母菌外，含有谷氨酸脫羧酶的大腸桿菌、霉菌、乳酸菌等也可用于GABA的生產(chǎn)[20]。羅少華等[21]以明膠為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，采用包埋-交聯(lián)復(fù)合固載法固定大腸桿菌細胞用于制備γ-氨基丁酸，雖然具有較高的轉(zhuǎn)化率，但安全性較差。邊鑫等[22]利用突變株米曲霉3.800接入大豆-水的培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)GABA為0.874 g/L。江南大學(xué)黃桂東等[23]從黃酒發(fā)酵過程中分離得到的一株具有產(chǎn)GABA能力的植物乳桿菌MJ0301進行了發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，產(chǎn)量為1.590 g/L。本實驗在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了輔酶磷酸吡哆醛，并且通過響應(yīng)面優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件，有效地提高了發(fā)酵GABA的產(chǎn)量，最終GABA產(chǎn)量高達4.300 g/L。

3 結(jié) 論

本研究通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗方法，以GABA產(chǎn)量為指標(biāo)，采用反相高效液相色譜鄰苯二甲醛柱前衍生法對發(fā)酵液中GABA含量進行測定，優(yōu)化了假絲酵母菌Y6產(chǎn)GABA發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件。確定了假絲酵母Y6發(fā)酵產(chǎn)GABA的最優(yōu)培養(yǎng)基配方：蔗糖23 g/L、麩皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L，最適發(fā)酵條件：初始 pH 4.5、培養(yǎng)溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、培養(yǎng)時間3.5 d。在此條件下，GABA產(chǎn)量達4.300 g/L，較優(yōu)化之前的2.500 g/L提高了72%。用響應(yīng)面法優(yōu)化假絲酵母Y6產(chǎn)GABA的發(fā)酵工藝條件是有效可行的。然而產(chǎn)量提高與多種因素有關(guān)，除了對菌種發(fā)酵條件的優(yōu)化以外，利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)改變GAD的酶活性來提高產(chǎn)γ-氨基丁酸的產(chǎn)量有待進一步研究。

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Optimization of Medium Components and Culture Conditions for Enhanced Yield of γ-Aminobutyric Acid by Candida sp. Y6 by Response Surface Methodology

ZHENG Hongyan1， ZHAO Weitong1， CHANG Yanxi2
(1. College of Food Science and Engineering， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2. Pharmacy College， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010100， China)

In this study， we optimized medium components and culture conditions of Candida sp. Y6， a γ-aminobutyric acid (GABA)-producing strain isolated from the surface of pitaya， using response surface methodology (RSM). The content of GABA in fermentation broth was analyzed by reversed phase high performance chromatography (RP-HPLC). The optimal fermentation medium was found to consist of 23 g/L sucrose， 65 g/L wheat bran， 6 g/L L-glutamate， and 0.5 mmol/L pyridoxal phosphate， and the optimal culture conditions were initial medium pH 4.5 and 28 ℃ for 3.5 d with a shaking speed of 200 r/min. Under the optimal conditions， the yield of GABA was increased 72% when compared with that before optimization.

γ-aminobutyric acid; Candida sp.; response surface methodology; medium components

TS201.3

A

1002-6630（2015）09-0130-06

10.7506/spkx1002-6630-201509024

2014-07-29

鄭鴻雁（1968—），女，副教授，碩士，研究方向為功能食品、微生物菌種篩選及發(fā)酵工藝。E-mail：zhenghongyan6811@163.com