朱啟迪，翁群珠，張改生*，巨 嵐，張 姣，于永昂，趙卓軍，牛 娜，王軍衛(wèi)，馬守才

（西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國(guó)家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心，國(guó)家小麥改良中 心楊凌分中心，小麥育種教育部工程研究中心，陜西省作物雜種優(yōu)勢(shì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 7121 00）

化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片和小穗中的殘留消解動(dòng)態(tài)

朱啟迪，翁群珠，張改生*，巨 嵐，張 姣，于永昂，趙卓軍，牛 娜，王軍衛(wèi)，馬守才

（西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國(guó)家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心，國(guó)家小麥改良中 心楊凌分中心，小麥育種教育部工程研究中心，陜西省作物雜種優(yōu)勢(shì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 7121 00）

建立化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片和小穗中殘留檢測(cè)的高效液相色譜法，并研究其在谷子葉片和小穗中的消解動(dòng)態(tài)。樣品經(jīng)乙腈提取，N-丙基乙二胺凈化，外標(biāo)法定量。該檢測(cè)方法在1～1 000 mg/L范圍內(nèi)，化學(xué)雜交劑SQ-1質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=30 377x+27 634，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，最低檢出限為0.05 mg/kg。在10～500 mg/kg添加范圍內(nèi)，化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片和小穗中的平均回收率為 87.0%～95.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.74%～2.28%。結(jié)果表明：化學(xué)雜交劑SQ-1可以從谷子葉片運(yùn)輸?shù)叫∷胫?，在小穗中的?dòng)態(tài)變化呈現(xiàn)出“先升高后降低”的趨勢(shì)。其在谷子葉片中的半衰期為1.83～2.08 d，在噴施21 d后葉片中幾乎檢測(cè)不到化學(xué)雜交劑SQ-1殘留，而在小穗中的半衰期為25.21～28.41 d，其消解速 度明顯慢于葉片中的消解速度。

谷子；化學(xué)雜交劑；殘留；消解動(dòng)態(tài)；高效液相色譜

谷子是我國(guó)重要的糧食作物，同時(shí)又具有很好的營(yíng)養(yǎng)保健功效。特別是其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸以及各種微量元素，在國(guó)外被譽(yù)為“營(yíng)養(yǎng)之王”[1-4]。谷子還具有抗干旱、耐貧瘠、適應(yīng)性廣等優(yōu)良特點(diǎn)[5-8]，但與其他作物相比，谷子產(chǎn)量較低，不過(guò)谷子具有很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，尤其是谷子的繁殖系數(shù)高，可以通過(guò)雜交種來(lái)提高谷子的產(chǎn)量和品質(zhì)[9-10]。我國(guó)在谷子雜種優(yōu)勢(shì)利用方面給予了足夠的重視，并取得了很大的進(jìn)展，先后開(kāi)展了“顯性雄性不育育種”[11]、“光溫敏不育兩系育種”[12-13]、“化學(xué)殺雄育種”[14]等方面的研究，其中化學(xué)殺雄具有選擇親本靈活，可以自由配制組合，無(wú)細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[15-18]，具有很廣泛的應(yīng)用前景。

SQ-1是我國(guó)自主研制的一種新型化學(xué)雜交劑，主要應(yīng)用在小麥[19]、小黑麥[20]、谷子[14]、糜子[21]等糧食作物上，具有很好的殺雄效果，雄性不 育率能達(dá)到95%～100%。但是谷子噴施完化學(xué)雜交劑SQ-1后，其植株中是否有化學(xué)雜交劑SQ-1殘留以及化學(xué)雜交劑SQ-1的動(dòng)態(tài)消解方面的研究，尚未見(jiàn)報(bào)道。目前，化學(xué)雜交劑SQ-1的提取方法主要有液-液萃取法[15]、固相萃取法[22]、分散固相萃取法[19]等，液-液萃取法和固相萃取法有機(jī)溶劑消耗量大、操作過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)力耗時(shí)等缺點(diǎn)，一般很少使用。本實(shí)驗(yàn)采用分散固相萃取法提取化學(xué)雜交劑SQ-1，高效液相色譜法檢測(cè)了谷子葉片和小穗中化學(xué)雜交劑SQ-1殘留，并研究了其在谷子植株中的消解動(dòng)態(tài)，旨在為化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子上的安全合理應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五九爪軟谷和榆林地方品種香谷由西北農(nóng)林科技大學(xué)柴巖教授提供；化學(xué)雜交劑SQ-1標(biāo)準(zhǔn)品由陜西省作物雜種優(yōu)勢(shì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；甲醇、乙腈（均為色譜純）、甲酸 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純）；分散凈化劑N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）；實(shí)驗(yàn)用水美國(guó)Milli-poreco公司超純水系統(tǒng)所制純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-15C高效液相色譜儀（紫外-可見(jiàn)雙波長(zhǎng)檢測(cè)器）、Wondasil C18色譜柱 日本島津科技有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q Biocel超純水機(jī) 美國(guó)Milli-poreco公司；SK-1快速混勻器 常州國(guó)華電器公司；移液器 德國(guó)Eppendorf公司；Filter Unit濾膜（0.22 μm）。

1.3 方法

1.3.1 田間樣品處理和采集

實(shí)驗(yàn)材料種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)田，參照雜交小麥大 田生產(chǎn)化學(xué)雜交劑SQ-1的噴施劑量，本實(shí)驗(yàn)采用高劑量（5 kg/hm2）噴施，噴施時(shí)間為谷子八葉期，噴施部位為谷子葉片。采集噴施化學(xué)雜交劑6 h及1、3、6、10、21 d后的葉片和1、3、6、10、21 d后小穗，同時(shí)噴施相同體積的水作為空白對(duì)照。采用多點(diǎn)隨機(jī)取樣法采集樣品，用液氮迅速研磨樣品，磨碎后—20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g磨碎后的樣品于15 mL的帶蓋離心管中，加入4 mL水，超聲波提取10 min（功率400 W）。加入2 g硫酸鎂和0.2 g氯化鈉，然后在混勻器上充分混勻，再加入50 ?L甲酸和5 mL乙腈，劇烈振蕩1 min，8 000 r/min離心3 min。取1 mL上清液于2 mL離心管中，加入25 mg PSA，然后在混勻器上充分振蕩1 min，8 000 r/min離心3 min，取上清液過(guò)0.22 ?m濾膜，待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：島津Wondasil C18（250 mm×4. 6 mm，5 μm）；流動(dòng)性：V（甲醇）∶V（水）∶V（乙酸）= 70∶30∶0.1；流速：1 mL/min；柱溫度：25 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；進(jìn)樣量：20 ?L。

1.3.4 SQ-1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液器準(zhǔn)確地移取適量的化學(xué)雜交劑SQ-1原藥，然后用超純水逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度為1、10、20、40、60、80、100、250、500、1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性關(guān)系、靈敏度、準(zhǔn)確度與精密度

按照1.3.3節(jié)色譜條件測(cè)定配制好的化學(xué)雜交劑SQ-1標(biāo)樣峰面積，以峰面積對(duì)溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，線性方程為y=30 377x+27 634（R2= 0.999 9），在1～1 000 mg/L范圍內(nèi)，化學(xué)雜交劑SQ-1質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，最低檢出限為0.05 mg/kg（按RSN=3計(jì)算）。

取1 g谷子葉片空白樣品，分別添加10、100、500 mg/kg三個(gè)水平的化學(xué)雜交劑SQ-1標(biāo)準(zhǔn)樣品，進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)6 次，取1 g谷子小穗空白樣品，分別添加10、25、50 mg/kg三個(gè)水平的化學(xué)雜交劑SQ-1標(biāo)準(zhǔn)樣品，進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)6 次，按照上述前處理方法和色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1?；瘜W(xué)雜交劑SQ-1在葉片和小穗中的回收率為87.0%～95.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.74%～2.28%，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析的標(biāo)準(zhǔn)?；?學(xué)雜交劑SQ-1標(biāo)準(zhǔn)樣品、谷子葉片空白樣品和空白樣品添加化學(xué)雜交劑SQ-1的色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 化學(xué)雜交劑SQ-1的添加回收率Table1 Recoveries of chemical hybridizing agent SQ-1 in spiked samples

圖1 SQ-1（100 mg/kg）（A）、空白葉片（B）和添加SQ--11（100 mg/kg）葉片（C）色譜圖Fig.1 Chromatograms of SQ-1 (100 mg/kg) (A), blank leaves (B) and leaves spiked with SQ-1 (100 mg/kg) (C)

2.2 化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片中的消解動(dòng)態(tài)

圖2 化學(xué)雜交劑在谷子葉片中的消解動(dòng)態(tài)Fig.2 Dynamic degradation curves of chemical hybridizing agent SQ-1 in foxtail millet leaves

谷子噴施化學(xué)雜交劑SQ-1后，在不同時(shí)間采樣進(jìn)行殘留量測(cè)定分析。由圖2可知：化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片中的殘留量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，其消解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。香谷在噴施6 h后葉片含量比較高，但是其消解速率比較快，它的消解曲線方程為C = 1.344e—0.36t，相關(guān)系數(shù)R2= 0.993，半衰期為t1/2= 1.83 d。五九爪軟谷在噴施6 h后葉片含量比較低，但是其消解速率稍慢，它的消解曲線方程為C = 0.884e—0.35t，相關(guān)系數(shù)R2= 0.952，半衰期為t1/2= 2.08 d。

2.3 化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子小穗中的消解動(dòng)態(tài)

在谷子噴施化學(xué)雜交劑SQ-1后，運(yùn)輸?shù)焦茸有∷胫行枰粋€(gè)過(guò)程，由圖3可知，剛開(kāi)始幾天檢測(cè)時(shí)其含量呈上升趨勢(shì)，然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)又逐漸下降，其消解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，在香谷和五九爪軟谷中消解曲線方程分別為C=168.4e—0.04t（R2= 0.992）；C=128.2e—0.03t（R2= 0.948），降解半衰期分別為2 5.21 d和28.41 d?；瘜W(xué)雜交劑SQ-1在香谷小穗中6 d后開(kāi)始降解，而在五九爪軟谷中3 d后就開(kāi)始降解，這可能與谷子品種的特異性相關(guān)。

圖3 化學(xué)雜交劑在谷子小穗中的消解動(dòng)態(tài)Fig.3 Dynamic degradation curves of chemical hybridizing agent SQ-1 in foxtail millet spikelets

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了檢測(cè)谷子葉片和小穗中化學(xué)雜交劑SQ-1殘留的高效液相色譜法，前處理方法在QuEChERS方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，操作簡(jiǎn)單快捷，極大地提高了檢測(cè)效率，完全符合農(nóng)藥殘留分析的要求。研究結(jié)果表明：化學(xué)雜交劑SQ-1在谷子葉片的降解速度比較快，半衰期為1.83～2.08 d，而在谷子小穗中的降解速度比較緩慢，半衰期為25.21～28.41 d，呈現(xiàn)出“先增加后降低”的動(dòng)態(tài)變化，它可以從谷子葉片運(yùn)輸?shù)焦茸有∷胫校⒃诠茸有∷胫蟹e累然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降解?；瘜W(xué)雜交劑SQ-1噴施21 d后谷子葉片中幾乎檢測(cè)不到其殘留，而小穗中還能檢測(cè)到殘留，一方面可能是因?yàn)閲娛┑膭┝看笥谡５膭┝?，從葉片運(yùn)輸?shù)叫∷胫械幕瘜W(xué)雜交劑SQ-1比較多，另一方面是因?yàn)榛瘜W(xué)雜交劑SQ-1在小穗中降解比較緩慢。

[1] 王玉文, 李會(huì)霞, 田崗, 等. 谷子高異交結(jié)實(shí)雄性不育系的創(chuàng)制及應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 43(4): 680-689.

[2] 李國(guó)營(yíng), 朱志華, 李為喜. 谷子(Setaria italica)分子遺傳研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2008, 9(4): 556-560.

[3] FUKUNAGA K, KAWASE M, KATO K. Structural variation in the Waxy gene and differentiation in foxtail millet [Setaria italica (L.) P. Beauv.]: implications for multiple origins of the waxy phenotype[J]. Molecular Genetics Genomics, 2002, 268(2): 214-222.

[4] KIM S K, SOHN E Y, LEE I J. Starch properties of native foxtail millet, Setaria italica Beauv.[J]. Journal Crop Science and Biotechnology, 2009, 12(1): 59-62.

[5] 張文英, 黃建明, 尉文彬. 我國(guó)谷子抗旱性研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(4): 1469-1470.

[6] LATA C, PRASAD M. Association of an allele-specific marker with dehydration stress tolerance in foxtail millet suggests SiDREB2 to be an important QTL[J]. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 2014, 23(1): 119-122.

[7] 山侖, 徐炳成. 論高粱的抗旱性及在旱區(qū)農(nóng)業(yè)中的地位[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(7): 2342-2348.

[8] FUKUNAGA K, KATO K. Mitochondrial DNA variation in foxtail millet, Setaria italica (L.) P. Beauv.[J]. Euphytica, 2002, 129(1): 7-13.

[9] 崔貴梅, 牛天堂, 張福耀. 谷子(Setaria italic Beauv.)高異交結(jié)實(shí)雄性不育系“81-16”的柱頭性狀觀察[J]. 作物學(xué)報(bào), 2007, 33(1): 149- 153.

[10] 夏雪巖, 劉正理, 程汝宏. 兩個(gè)谷子新不育系幾個(gè)性狀的配合力評(píng)價(jià)和遺傳力分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2013, 15(1): 116-122.

[11] 袁進(jìn)成, 石 云素, 胡洪凱, 等. 谷子顯性雄性不育基因Msch的AFLP標(biāo)記[J]. 作物學(xué)報(bào), 2005, 31(10): 1295-1299.

[12] 趙治 海, 崔文生, 杜貴, 等. 谷子光(溫)敏不育系821選育及其不育性與光、溫關(guān)系的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 1996, 29(5): 23-31.

[13] 郝曉芬, 王志民, 王根全, 等. SSR方法標(biāo)記谷子光敏雄性不育基因[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2011, 26(5): 112-116.

[14] 宋瑜龍, 王亮明, 張改生, 等. 殺雄劑SQ-1誘導(dǎo)谷子雄性不育研究[J].作物學(xué)報(bào), 2011, 37(9): 1695-1700.

[15] 朱啟迪, 張改生, 趙新亮, 等. 超聲輔助提取高效液相色譜法檢測(cè)小麥籽粒中殺雄嗪酸的殘留[J]. 分析化學(xué), 2012, 40(3): 462-465.

[16] PARODI, GAJU M. Male sterility induced by the chemical hybridizing agent clofencet on wheat, Triticum aestivum and T. turgidum var. durum[J]. Ciencia E Investigacion Agraria, 2009, 36(2): 267-276.

[17] CHAKRABORTY K, DEVAKUMAR C. Evaluation of chemical compounds for induction of male sterility in wheat (Triticum aestivum L.)[J]. Euphytica, 2006, 147(3): 329-335.

[18] 張明珠, 袁蕾, 王俊生, 等. 順烏頭酸酶基因在殺雄劑SQ-1誘導(dǎo)小麥雄性不育花藥中的表達(dá)分析[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2010, 26(8): 740-748.

[19] 朱啟迪, 桑青, 王春平, 等. 高效液相色譜法測(cè)定小麥籽粒中殺雄嗪酸殘留[J]. 分析化學(xué), 2013, 41(4): 565-569.

[20] 張彩霞, 柴守誠(chéng), 董永梅. 等 化學(xué)雜交劑SQ-1誘導(dǎo)小黑麥雄性不育效果研究初報(bào)[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005(3): 38-40.

[21] 崔秀輝. 化學(xué)雜交劑SQ-1誘導(dǎo)糜子雄性不育效果研究[J]. 作物學(xué)報(bào), 2008, 34(1): 106-110.

[22] AOYAQI M, NIIYAMA K, NEMOTO S. Analytical method of clofencet in animal fishery products by LC/MS[J]. Journal of the Food Hygienic Society of Japan, 2011, 52(3): 156-160.

Residues and Decline of Chemical Hybridizing Agent SQ-1 in Leaves and Spikelets of Foxtail Millet

ZHU Qidi, WENG Qunzhu, ZHANG Gaisheng*, JU Lan, ZHANG Jiao, YU Yong’ang,
ZHAO Zhuojun, NIU Na, WANG Junwei, MA Shoucai (Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province, Wheat Breeding Engineering Research Center, Ministry of Education, Yangling Branch of State Wheat Improvement Center, National Yangling Agricultural Biotechnology & Breeding Center, College of Agriculture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

A high performance liquid chromatography method was developed for determining chemical hybridizing agent SQ-1 and its dissipation curve in leaves and spikelets of foxtail millet. The samples were extracted with acetonitrile, cleaned up with N-propylethylenediamine (PSA) and quantified by the external standard method. There was a good linear relationship between the peak area and concentration of SQ-1 over the range from 1 to 1 000 mg/L, and the linear equation was y = 30 377x + 27 634, with a correlation coefficient of 0.999 9. T he lowest detectable concen tration was 0.05 mg/kg. The mean recoveries of SQ-1 in leaves and spikelet of foxtail millet varied from 87.0% to 95.5% with a relative standard deviation ranging from 0.74% to 2.28% at fortification levels of 10–500 mg/kg. The results indicated that SQ-1 could be transported from leaves to spikelets. The trend of SQ-1 residual dynamics was first increased and then decreased. The halflives of SQ-1 were 1.83–2.08 days in leaves and no SQ-1 pesticide residues were detected after 21 days. The half-lives of SQ-1 were 25.21–28.41 days in spikelets, and its degradation rate in spikelets was significantly lower than in leaves. Key words: foxtail millet; chemical hybridizing agent; residues; degradation kinetics; high performance liquid chromatography (HPLC)

S482.8

A

1002-6630（2015）04-0181-04

10.7506/spkx1002-6630-201504035

2014-03-25

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA10A106）；國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目（311 71611；31371697）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃課題（2014KTZB02-01-02）

朱啟迪（1984—），男，博士研究生，研究方向?yàn)樽魑镄坌圆挥龣C(jī)理。E-mail：zzhhqqdd@163.com

*通信作者：張改生（1951—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樽魑镫s種優(yōu)勢(shì)研究與利用。E-mail：zhanggsh58@aliyun.com