李天芝，于新友，沈志強,2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州　256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州　256600）

枯草芽孢桿菌特異性PCR快速檢測方法的建立和應(yīng)用

李天芝1，于新友1，沈志強1,2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

參照GenBank中登錄的枯草芽孢桿菌16S rRNA基因，設(shè)計1對引物，擴增片段大小為460 bp的基因片段，該方法對枯草芽孢桿菌檢測的靈敏性為1pg總DNA量，對枯草芽孢桿菌DNA的擴增結(jié)果為陽性，對照菌株擴增結(jié)果均為陰性，成功地建立枯草芽孢桿菌PCR檢測方法，且該方法具有快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。

枯草芽孢桿菌；16S rRNA基因；PCR；方法

枯草芽孢桿菌是一種可形成芽孢的好氧革蘭氏陽性菌，該菌具有生長條件簡單、耐溫度變化、快速復(fù)活、快速生長和較強分泌酶等特點[1]。枯草芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，在自然界中分布廣泛，易于分離培養(yǎng)，對人畜無毒無害，能產(chǎn)生脂肽類、氨基酸和磷脂類等多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性，可改善動物腸道菌群結(jié)構(gòu)，增強免疫力，促進(jìn)生長發(fā)育，提高生產(chǎn)性能的作用[2-3]。近年來，國內(nèi)外對于枯草芽孢桿菌在飼料加工方面的應(yīng)用有大量相關(guān)報道。豬飼料中添加一定量的枯草芽孢桿菌，能增強仔豬免疫力、提高生長性能[4]。蛋雞飼料中添加枯草芽孢桿菌，即能增加種雞的產(chǎn)蛋量和合格率，還能提高蛋的受精率、孵化率和健雛率[5]。肉雞飼料中添加枯草芽孢桿菌能改善其腸黏膜的抗氧化和免疫功能，從而提高肉雞的生長性能[6]?？莶菅挎邨U菌添加到奶牛飼料中，能顯著提高奶牛產(chǎn)奶性能（P＜0.05）[7]。枯草芽孢桿菌添加到兔飼料中，能顯著促進(jìn)幼兔腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育[8]。16S rRNA基因可作為細(xì)菌鑒定的一種靶基因，在巴氏桿菌、蛭弧菌和鏈球菌等細(xì)菌種屬鑒定方面均有相關(guān)報道[9]。本研究根據(jù)GenBank登錄的枯草芽孢桿菌16S rRNA基因，設(shè)計引物，建立了枯草芽孢桿菌的PCR快速檢測方法。

1　材料與方法

1.1菌種和試劑

枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、弗氏弧菌、地衣芽孢桿菌均由實驗室保存。DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，馬丁肉湯培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司，rTaq聚合酶（Polymerase）購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2引物設(shè)計、合成

參照Genbank登錄的枯草芽孢桿菌16S rRNA基因序列（KF641815），用Primer primer5.0軟件分析后，設(shè)計1對引物：16S rRNA-F：5'-GGACG?GCTGAGTAACACG-3'，16S rRNA-R：5'-GACAA CGCTTGCCACCTA-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3PCR模板制備

將枯草芽孢桿菌菌種接種馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～20 h后，12 000 rpm離心2 min，PBS洗滌2次后，參照基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取細(xì)菌基因組DNA，同時提取其他幾種對照菌的DNA作為模板。

1.4PCR反應(yīng)體系和程序

分別對PCR反應(yīng)的所用的引物濃度（0.2～1.2 μmol·L-1，每0.2 μmol·L-1為1個梯度）和退火溫度（48～58℃梯度溫度，每2℃為1個梯度）進(jìn)行優(yōu)化，最后確定的擴增體系為：10×buffer 5 μL，dNTP 5 μL，引物16S rRNA-F 1 μL、引物16S rRNA-R 1 μL，rTaq Polymerase 0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至50 μL。反應(yīng)程序為：95℃5 min，94℃30 s，52℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)。

1.5PCR產(chǎn)物電泳檢測和測序分析

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物5 μL，進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況，如果有目的基因擴增條帶，用試劑盒回收后，與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，提取初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測得序列與參照的枯草芽孢桿菌序列進(jìn)行相似性比較。

1.6特異性檢測

分別以提取的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、弗氏弧菌、地衣芽孢桿菌等6種細(xì)菌的基因組DNA作為模板，采用已建立的方法進(jìn)行PCR檢測。

1.7敏感性檢測

測定制備的枯草芽孢桿菌DNA濃度，然后做不同程度的稀釋，使DNA的含量分別為10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1和0.1 pg·μL-1，分別取1 μL作為模板，按1.4優(yōu)化的方法進(jìn)行樣品的加樣和擴增反應(yīng)。

1.8重復(fù)性檢驗

為驗證該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性，采用建立的方法，分別重復(fù)檢測3次枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、弗氏弧菌、地衣芽孢桿菌的等6種細(xì)菌基因組DNA。

1.9檢測方法的應(yīng)用

采用已經(jīng)建立的方法對本實驗室已經(jīng)分離和保存的42株疑似枯草芽孢桿菌檢測，將擴增的PCR產(chǎn)物全部測序，并與GenBank公布的序列進(jìn)行比對和序列分析。并同時參照文獻(xiàn)進(jìn)行檢驗，比較二者的符合性[10-11]。

2　試驗結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物的檢測和序列鑒定

PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果見圖1。將測得序列與GenBank登錄的序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示與枯草芽孢桿菌（登錄號：KF641815）相應(yīng)序列的相似性為100%。將PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，在460 bp處可見一條特異性目的條帶，見圖2。

2.2特異性檢測

PCR特異性擴增檢測結(jié)果表明，只有以枯草芽孢桿菌DNA為模板時才能擴增出460 bp的預(yù)期目的帶，而對照菌株均無任何條帶擴增，見圖3。因此，建立的該PCR檢測方法特異性良好。

圖1　擴增產(chǎn)物測序結(jié)果

圖2　枯草芽孢桿菌PCR擴增結(jié)果

圖3　特異性實驗

2.3敏感性檢測

通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，分別取5 μL樣品電泳，結(jié)果表明，該PCR方法可檢測的枯草芽孢桿菌的DNA的最低量為1pg，見圖4。

2.4重復(fù)性檢驗

重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，3次重復(fù)試驗結(jié)果無任何差別，說明該方法有很好重復(fù)性，見圖5。

2.5檢測方法的應(yīng)用

經(jīng)PCR檢測和測序可知，42株疑似枯草芽孢桿菌分離菌中有7株為枯草芽孢桿菌，與采用相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測結(jié)果完全一致，見圖6。

圖4　敏感性實驗

圖5　重復(fù)性實驗

圖6　檢測方法應(yīng)用

3　討論

傳統(tǒng)的枯草芽孢桿菌實驗室檢測方法（病原分離與生化鑒定等）操作繁瑣，耗時長，費用高，準(zhǔn)確性差，不能滿足基層工作者對枯草芽孢桿菌的快速和準(zhǔn)確鑒定的需求。PCR方法以其特異性好、敏感性高和快速的特點已經(jīng)廣泛用于細(xì)菌菌種鑒別、疾病臨床診斷和土壤微生物等多種領(lǐng)域。枯草芽孢桿菌存在于健康動物的腸道中，目前，已經(jīng)從豬、雞、牛等多種動物體內(nèi)成功分離到了枯草芽孢桿菌，并對其特性做了鑒定，為微生態(tài)制劑的研究奠定了基礎(chǔ)[11-13]。但從動物體內(nèi)分離到的細(xì)菌眾多，本試驗枯草芽孢桿菌PCR檢測方法的建立，能快速的從多種分離菌中，對枯草芽孢桿菌做出甄別和初步篩選，從而減少工作強度。枯草芽孢桿菌能抑制大腸桿菌、沙門氏菌多種腸道致病菌的生長，而為乳酸桿菌等有益菌的生長提供適宜的生長環(huán)境，從而保持腸道菌群的平衡，提高動物機體抗病能力，同時枯草芽孢桿菌具有耐受高溫、耐酸、耐擠壓等特點，在飼料加工和儲存過程中不易失活[14-15]。作為一種飼料添加劑，具有無毒無害、無殘留等優(yōu)點，能提高動物對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，增強動物抗病力，提高生產(chǎn)性能。采用本試驗建立的枯草芽孢桿菌PCR檢測方法，可對畜禽飼料中添加的枯草芽孢桿菌進(jìn)行快速檢測和鑒別。

[1]惠明,竇麗娜,田青,等.枯草芽孢桿菌的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36（27）:11 623-11 624.

[2]宮宇飛,喬紅萍,魏國榮,等.內(nèi)生枯草芽孢桿菌E1R-J發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,17（1）:61-64.

[3]李晶,楊謙.生防枯草芽孢桿菌的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008,36（1）:106-111.

[4]祝天龍,李奎,邵強,等.枯草芽孢桿菌制劑對仔豬生長及免疫的影響[J].飼料研究,2015（3）:26-31.

[5]劉影,田國民,張崢,等.枯草芽孢桿菌對蛋種雞生產(chǎn)性能的影響[J].飼料工業(yè),2010,31（16）:33-34.

[6]李衛(wèi)芬,文靜,吳紅照,等.枯草芽孢桿菌對肉雞生長性能和腸黏膜抗氧化及免疫功能的影響[J].中國畜牧雜志,2011,47 （9）:58-61.

[7]王振華,潘康成,張均利,等.枯草芽孢桿菌制劑在奶牛生產(chǎn)上的應(yīng)用研究[J].飼料廣角,2005（19）:31-32.

[8]湯際亮,張煜坤,孫得發(fā),等.獺兔盲腸中枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013（19）:149-151, 179.

[9]侯曉麗,陳智.分類及鑒別細(xì)菌的新靶標(biāo)—gyrB基因[J].國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志,2005,32（1）:38-41.

[10]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T26428-2010飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011.

[11]陳江,冉雪琴,王嘉福.香豬肺源性枯草芽孢桿菌的分離鑒定及體外抑菌作用[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43（6）:108-112.

[12]王彬,曹允考,魏亞松,等.雞腸道枯草芽孢桿菌的分離鑒定及生物特性研究[J].飼料博覽,2014（2）:1-6.

[13]溫建新,任慧英,劉文華,等.荷斯坦成年奶?？莶菅挎邨U菌的分離與鑒定[J].青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）,2015,32（1）: 19-21,26.

[14]李桂杰,張鈞利.動物微生態(tài)制劑的研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè), 2000,21（11）:16-18.

[15]張以芳.微生物飼料的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景[J].中國飼料,2001（3）: 12-13.

Establishment and Application of a Specific PCR Assay for Detection ofBacillus Suhtilis

LI Tianzhi1,YU Xinyou1,SHEN Zhiqiang1,2

（1.Shandong Lvdu Biological Technology Co.,Ltd.,Binzhou Shandong 256600,China 2.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Binzhou Shandong 256600 China）

A PCR assay for detection of Bacillus suhtilis was established using a pair of primers based on the 16S rRNA gene of Bacillus suhtilis.The size of the amplified product was 460 bp,and the specificity,sensitivity were studied.This method specifically amplified a fragment from Bacillus suhtilis with a detection limit of 1pg DNA of Bacillus suhtilis.Therefore the establishing PCR technique provided a sensitive,specific,fast and reliable method for diagnosis and epizootic study of the Bacillus suhtilis.

Bacillus suhtilis;16S rRNA gene;PCR;method

S852.61+6；S816.7

A

1001-0084（2015）12-0024-04

2015-11-16

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-06-022-15）；山東省現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團隊生產(chǎn)與環(huán)境控制創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-13-011-10）；山東省現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-12-011-12）；山東省現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系毛皮動物創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-18-011-15）

李天芝（1985-），女，山東菏澤人，碩士，助理研究員，主要從事畜禽疾病診斷與防控研究。