祝艷秋，陸璐，李林，蔡彥寧，張?zhí)m

時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化頻率隨增齡的組織特異性改變①

祝艷秋1a，陸璐1a，李林1a，蔡彥寧1b，張?zhí)m1a

目的探索時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化頻率增齡性改變及其在衰老中的作用。方法4月齡(青年組，n=9)、20月齡(老年組，n=10)C57BL小鼠，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測(cè)小鼠胃、脾、血管、腎、紋狀體中時(shí)鐘基因Per1/2、Bmal1/2、Cry1/2、Clock、Npas2啟動(dòng)子甲基化水平。結(jié)果老年組脾組織Cry1、Bmal2和NPas2啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率高于青年組(P＜0.05)，胃組織Per1基因啟動(dòng)子甲基化頻率低于青年組(P＜0.05)，血管組織Bmal1啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率高于青年組(P＜0.05)。結(jié)論多種時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化可能參與衰老進(jìn)程，并具有組織特異性。

衰老；晝夜節(jié)律；時(shí)鐘基因；啟動(dòng)子甲基化

[本文著錄格式]祝艷秋，陸璐，李林，等.時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化頻率隨增齡的組織特異性改變[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2015,21(5):514-518.

CITED AS:Zhu YQ,Lu L,Li L,et al.Tissue-specific changes of clock DNA promoter methylation with aging[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(5):514-518.

晝夜節(jié)律是生物體內(nèi)廣泛存在的一種生命時(shí)鐘，其周期約為24 h，它可以在分子生物學(xué)、生理學(xué)水平對(duì)大腦及外周等各種器官組織功能產(chǎn)生影響。研究顯示，衰老能夠?qū)е聲円构?jié)律異常，包括活動(dòng)高峰幅度降低以及節(jié)律丟失；時(shí)鐘基因表達(dá)及功能紊亂也影響衰老相關(guān)疾病，如老年健康女性發(fā)生晝夜活動(dòng)節(jié)律減少，此類節(jié)律的延后將增加其患癡呆癥和輕度認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)，增加其死亡風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。

晝夜節(jié)律由多種時(shí)鐘基因，如Per1/2、Cry1/2、 Clock、Npas2、Bmal1/2等控制[4]。時(shí)鐘基因具有節(jié)奏性的表達(dá)由相互關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄反饋/前饋回路產(chǎn)生，從而驅(qū)動(dòng)生理和行為節(jié)律[5-6]。時(shí)鐘基因DNA啟動(dòng)子CpG島區(qū)域甲基化是基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)控方法之一。有研究證實(shí)，時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化水平升高能抑制基因表達(dá)[7]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，衰老相關(guān)疾病患者體內(nèi)存在部分時(shí)鐘基因甲基化異常，如帕金森病患者體內(nèi)Npas2基因啟動(dòng)子甲基化水平顯著降低[8-9]。

以前的研究證實(shí)，在C57小鼠組織中存在多種時(shí)

鐘基因啟動(dòng)子的甲基化[10]。本研究觀察C57衰老小鼠不同組織時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化的增齡性改變，探索時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化在衰老過(guò)程中的作用，以及時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化在中樞和外周組織中的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

Wizard DNA purification resin：PROMEGA公司。CpG甲基化酶SssI：NEW ENGLAND BIOLAB公司。HS Taq：TAKARA公司。引物合成：上海生工生物有限公司。

1.2 動(dòng)物

雄性C57BL/6J小鼠，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，許可證號(hào)SCXK(軍)2007-004。3月齡小鼠10只飼養(yǎng)17個(gè)月至20月齡，作為老年組。老年組飼養(yǎng)至19月齡時(shí)，另購(gòu)入3月齡小鼠9只飼養(yǎng)1個(gè)月至4月齡作為青年組。明暗時(shí)間為12 h∶12 h，室溫恒溫23℃，任意攝取水食。

1.3 取材

所有小鼠至預(yù)定月齡后，于同一時(shí)間點(diǎn)全部處死。取小鼠新鮮組織胃、血管、脾、腎及紋狀體，凍存于-80℃待用。

1.4 甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

按TIANamp Genomic DNA Kit說(shuō)明書提取小鼠基因組DNA。使用偏重亞硫酸鈉和對(duì)苯二酚對(duì)基因組DNA進(jìn)行處理，使未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶則未發(fā)生轉(zhuǎn)化。采用在線軟件(www.mspprimer.org/cgi-mspprimer/design.cgi)分析時(shí)鐘基因Per1/2、Cry1/2、Clock、Npas2、Bmal1/2的啟動(dòng)子序列，并用該軟件設(shè)計(jì)每個(gè)時(shí)鐘基因的甲基化引物和非甲基化引物各一套[11]。DNA啟動(dòng)子區(qū)域出現(xiàn)部分甲基化以“PM”表示，未出現(xiàn)甲基化以“U”表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件。采用Fisher確切概率法對(duì)各組不同部位8種時(shí)鐘基因的甲基化頻率分別進(jìn)行比較。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 紋狀體

青年組Cry1、Cry2啟動(dòng)子甲基化，老年組Cry1啟動(dòng)子甲基化。老年組Cry1和Cry2甲基化率與青年組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 脾

青年組各時(shí)鐘基因啟動(dòng)子均無(wú)甲基化，老年組Cry1、Bmal2和Npas2啟動(dòng)子區(qū)甲基化率比青年組升高(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 兩組小鼠紋狀體時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平(n)

表2 兩組小鼠脾組織時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平(n)

2.3 胃

青年組和老年組Per1、Cry1和Bmal1啟動(dòng)子均有甲基化。老年組Per1啟動(dòng)子甲基化率降低(P＜0.05)，而Cry1和Bmal1啟動(dòng)子甲基化率與青年組相比無(wú)顯著

性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 血管

青年組Bmal1、Bmal2啟動(dòng)子甲基化，老年組Cry1、Cry2、Bmal1啟動(dòng)子甲基化，老年組Bmal1甲基化率比青年組升高(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表3 兩組小鼠胃組織時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平(n)

表4 兩組小鼠血管組織時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平(n)

2.5 腎

青年組Cry1和Bmal2啟動(dòng)子甲基化，老年組Cry1啟動(dòng)子甲基化，兩組各基因啟動(dòng)子甲基化率均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表5。

表5 兩組小鼠腎組織時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平(n)

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，衰老個(gè)體及衰老相關(guān)疾病患者體內(nèi)出現(xiàn)晝夜節(jié)律的異常[12]。晝夜節(jié)律由多種時(shí)鐘基因調(diào)控[4]，其DNA啟動(dòng)子CpG島區(qū)域甲基化是基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳主要調(diào)控方法之一[13]。檢測(cè)時(shí)鐘基因的RNA水平是研究基因表達(dá)水平較直接的手段，但由于RNA檢測(cè)對(duì)于樣本提取的要求較高，導(dǎo)致該法的應(yīng)用較為局限。已有文獻(xiàn)證實(shí)，DNA甲基化水平增高能夠抑制基因表達(dá)[7]，因此，本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)檢測(cè)DNA甲基化水平，間接反映基因表達(dá)的變化。該法對(duì)樣本要求較低，操作快速簡(jiǎn)單，具有更高的使用價(jià)值。由于MSP為定性檢測(cè)，我們通過(guò)比較樣本中甲基化的發(fā)生頻率，檢測(cè)DNA啟動(dòng)子CpG島區(qū)域甲基化水平差異。

Cry基因是生物鐘基因負(fù)反饋環(huán)的主要成員[14]。Cry基因所表達(dá)的隱花色素(Cryptochrome)是一種感光受體，能夠調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，以及動(dòng)植物的生物節(jié)律[15]。以往研究發(fā)現(xiàn)，衰老果蠅Cry基因mRNA和蛋白表達(dá)均顯著減少[16]。Cry1和Cry2缺陷小鼠作為衰老模型，與野生型小鼠相比不僅認(rèn)知功能降低，而且睡眠周期紊亂[17]。本研究顯示，Cry1啟動(dòng)子甲基化在老年組中樞神經(jīng)組織和外周組織中均出現(xiàn)，尤其在衰老小鼠脾中，Cry1啟動(dòng)子甲基化頻率比青年組增

高。已有證據(jù)顯示，DNA的甲基化能夠?qū)е虏豢赡娴膯?dòng)子沉默，從而下調(diào)基因表達(dá)[7]。有研究證實(shí)，Cry1和Cry2的減少能夠?qū)е缕⒓?xì)胞中腫瘤壞死因子-α和活化的CD3+/CD69+T細(xì)胞增多[18]。脾組織Cry1啟動(dòng)子甲基化增高，下調(diào)Cry1表達(dá)，可能加速免疫系統(tǒng)的衰老進(jìn)程。

Bmal1在時(shí)鐘基因轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路中起正向調(diào)節(jié)作用，它與視交叉上核以及外周時(shí)鐘細(xì)胞的生物節(jié)律高度相關(guān)[19]。已有研究指出，Bmal1功能障礙會(huì)導(dǎo)致生物鐘紊亂，且Bmal1缺失(Bmal1-/-)小鼠壽命減少，過(guò)早表現(xiàn)出衰老相關(guān)的表型[20-21]。研究證實(shí)，Bmal1基因缺失能在衰老過(guò)程中輕度影響血管促凝和抗凝途徑，隨著衰老進(jìn)程，內(nèi)皮功能障礙增加，血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加[22]。Bmal1啟動(dòng)子甲基化在血管組織中增加，下調(diào)Bmal1基因表達(dá)，可能引起衰老相關(guān)血管疾病。

作為Bmal1的旁系同源物，Bmal2同樣被證實(shí)與衰老相關(guān)。近期一項(xiàng)研究顯示，Bmal2的基因多態(tài)性與中國(guó)人對(duì)阿爾茨海默病的易感性相關(guān)[23]。Bmal2在帕金森病患者特定時(shí)間的白細(xì)胞中表達(dá)水平降低，提示Bmal2與衰老或疾病引起的免疫細(xì)胞功能異常相關(guān)[24]。本研究顯示，Bmal2啟動(dòng)子甲基化頻率在老年小鼠脾組織中明顯升高，導(dǎo)致Bmal2在脾組織中表達(dá)降低，可能加速脾組織衰老進(jìn)程。有待進(jìn)一步探究。

Npas2最初在哺乳動(dòng)物前腦中發(fā)現(xiàn)，但已被證明在外周組織中同樣表達(dá)[25]。它作為生物節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子，與Bmal1形成二聚體，激活其他核心時(shí)鐘基因[26]。研究證實(shí)，Npas2與衰老存在聯(lián)系，Npas2與Clock基因共同減少能夠?qū)е滤ダ舷嚓P(guān)的神經(jīng)退行性病變[27]。有研究指出，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)Npas2的表達(dá)延遲，影響白細(xì)胞介素的節(jié)律性生產(chǎn)，在諸多時(shí)鐘基因中，它是與人體免疫炎癥狀態(tài)最相關(guān)的基因之一[28]。Npas2在衰老脾組織中甲基化頻率增加，下調(diào)脾中Npas2的表達(dá)，可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)老化，從而引起免疫相關(guān)疾病。

Per1是時(shí)鐘基因負(fù)反饋調(diào)控的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，它與Cry基因相互作用后抑制Clock/Bmal1二聚體的轉(zhuǎn)錄活性[29]。Per1基因不僅是主要的時(shí)鐘基因，其表達(dá)存在節(jié)律性并且與衰老高度相關(guān)[30-31]。目前針對(duì)Per1作用于衰老的研究較少。本研究顯示，衰老小鼠胃組織中Per1基因啟動(dòng)子甲基化頻率低于青年組，表明衰老小鼠胃組織Per1表達(dá)增加，可能引起衰老所致的胃功能減退。

我們的研究顯示，衰老小鼠脾、胃和血管組織中均出現(xiàn)時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化頻率的改變，特別是在衰老小鼠脾組織中，Cry1、Bmal2、Npas2的甲基化頻率均顯著減少，提示時(shí)鐘基因甲基化改變可能與免疫系統(tǒng)的老化相關(guān)性較高。此外，衰老小鼠胃組織Per1啟動(dòng)子甲基化頻率降低，血管組織Bmal1啟動(dòng)子甲基化頻率升高，而中樞神經(jīng)組織紋狀體中并未出現(xiàn)甲基化頻率的改變?；谝陨辖Y(jié)果，我們的研究提示，時(shí)鐘基因啟動(dòng)子在衰老小鼠不同組織中甲基化頻率的改變存在差異，時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化的增齡性改變具有組織特異性。

紋狀體作為中樞神經(jīng)組織，其時(shí)鐘基因甲基化水平與外周的脾、胃和血管組織存在明顯差異。衰老小鼠模型中樞組織時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率較低，而外周組織時(shí)鐘基因甲基化發(fā)生率較高。雖然有研究發(fā)現(xiàn)，衰老小鼠、大鼠以及阿爾茨海默病患者腦組織整體基因組DNA甲基化水平有所降低[32]，但目前尚無(wú)針對(duì)衰老個(gè)體中樞組織時(shí)鐘基因啟動(dòng)子CpG島甲基化的研究報(bào)道。我們認(rèn)為，衰老小鼠中樞組織時(shí)鐘基因啟動(dòng)子CpG島甲基化可能不是導(dǎo)致其晝夜節(jié)律改變的主要因素。

綜上所述，衰老小鼠時(shí)鐘基因Cry1、Per1、Bmal1、Bmal2、Npas2啟動(dòng)子CpG區(qū)域甲基化頻率與青年小鼠相比有顯著性差異，這種差異存在明顯的組織特異性，提示時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)生物鐘的調(diào)節(jié)在衰老小鼠不同組織中的作用可能不同。時(shí)鐘基因Cry1、Per1、Bmal1/2、Npas2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與衰老相關(guān)，可能作為抗衰老藥物研究的新靶點(diǎn)。

[1]Tranah GJ,Blackwell T,Ancoli-Israel S,et al.Circadian activity rhythms and mortality:the study of osteoporotic fractures[J].JAm Geriatr Soc,2010,58(2):282-291.

[2]Tranah GJ,Blackwell T,Stone KL,et al.Circadian activity rhythms and risk of incident dementia and mild cognitive impairment in older women[J].Ann Neurol,2011,70(5): 722-732.

[3]Yu EA,Weaver DR.Disrupting the circadian clock:gene-specific effects on aging,cancer,and other phenotypes[J].Aging (Albany NY),2011,3(5):479-493.

[4]Fu L,Kettner NM.The circadian clock in cancer development and therapy[J].Prog Mol Biol Transl Sci,2013,119:221-282.

[5]Arellanes-Licea E,Caldelas I,De Ita-Perez D,et al.The circadian timing system:a recent addition in the physiological mecha-

nisms underlying pathological and aging processes[J].Aging Dis,2014,5(6):406-418.

[6]Reppert SM,Weaver DR.Coordination of circadian timing in mammals[J].Nature,2002,418(6901):935-941.

[7]Klose RJ,Bird AP.Genomic DNA methylation:the mark and its mediators[J].Trends Biochem Sci,2006,31(2):89-97.

[8]Lim AS,Srivastava GP,Yu L,et al.24-hour rhythms of DNA methylation and their relation with rhythms of RNA expression in the human dorsolateral prefrontal cortex[J].PLoS Genet, 2014,10(11):e1004792.

[9]Lin Q,Ding H,Zheng Z,et al.Promoter methylation analysis of seven clock genes in Parkinson's disease[J].Neurosci Lett, 2012,507(2):147-150.

[10]Ji Y,Qin Y,Shu H,et al.Methylation analyses on promoters of mPer1,mPer2,and mCry1 during perinatal development[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,391(4):1742-1747.

[11]林慶玲,蔡彥寧,袁艷鵬,等.小鼠外周組織時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2012,32(10):1118-1125.

[12]Landry GJ,Liu-Ambrose T.Buying time:a rationale for examining the use of circadian rhythm and sleep interventions to delay progression of mild cognitive impairment to Alzheimer's disease[J].FrontAging Neurosci,2014,6:325.

[13]Ndlovu MN,Denis H,Fuks F.Exposing the DNA methylome iceberg[J].Trends Biochem Sci,2011,36(7):381-387.

[14]Destici E,Jacobs EH,Tamanini F,et al.Altered phase-relationship between peripheral oscillators and environmental time in Cry1 or Cry2 deficient mouse models for early and late chronotypes[J].PLoS One,2013,8(12):e83602.

[15]Yu X,Liu H,Klejnot J,et al.The Cryptochrome Blue Light Receptors[J].TheArabidopsis Book,2010,8:e135.

[16]Rakshit K,Giebultowicz JM.Cryptochrome restores dampened circadian rhythms and promotes healthspan in aging Drosophila[J].Aging Cell,2013,12(5):752-762.

[17]Van der Zee EA,Havekes R,Barf RP,et al.Circadian time-place learning in mice depends on Cry genes[J].Curr Biol,2008,18(11):844-848.

[18]Hashiramoto A,Yamane T,Tsumiyama K,et al.Mammalian clock gene Cryptochrome regulates arthritis via proinflammatorycytokine TNF-alpha[J].JImmunol,2010,184(3): 1560-1565.

[19]Bunger MK,Wilsbacher LD,Moran SM,et al.Mop3 is an essential component of the master circadian pacemaker in mammals[J].Cell,2000,103(7):1009-1017.

[20]Kondratov RV,Kondratova AA,Gorbacheva VY,et al.Early aging and age-related pathologies in mice deficient in BMAL1, the core componentof the circadian clock[J].Genes Dev,2006, 20(14):1868-1873.

[21]Khapre RV,Kondratova AA,Patel S,et al.BMAL1-dependent regulation of the mTOR signaling pathway delays aging[J].Aging(Albany NY),2014,6(1):48-57.

[22]Hemmeryckx B,Van Hove CE,Fransen P,et al.Progression of the prothrombotic state in aging Bmal1-deficient mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(11):2552-2559.

[23]Qing-Xiu L,Chang-Quan H,Qian C,et al.The polymorphism of ARNTL2(BMAL2)gene rs2306074 C＞T is associated with susceptibility of Alzheimer disease in Chinese population[J]. Neurol Sci,2014,35(11):1743-1747.

[24]Ding H,Liu S,Yuan Y,et al.Decreased expression of Bmal2 in patients with Parkinson's disease[J].Neurosci Lett,2011, 499(3):186-188.

[25]Ptitsyn AA,Zvonic S,Conrad SA,et al.Circadian clocks are resounding in peripheral tissues[J].PLoS Comput Biol,2006,2 (3):e16.

[26]Crumbley C,Wang Y,Kojetin DJ,et al.Characterization of thecoremammalianclockcomponent,NPAS2,asa REV-ERBα/RORα target gene[J].J Biol Chem,2010,285 (46):35386-35392.

[27]Musiek ES,Lim MM,Yang G,et al.Circadian clock proteins regulateneuronalredoxhomeostasisandneurodegeneration[J].J Clin Invest,2013,123(12):5389-5400.

[28]Kouri VP,Olkkonen J,Kaivosoja E,et al.Circadian timekeeping is disturbed in rheumatoid arthritis at molecular level[J]. PLoS One,2013,8(1):e54049.

[29]Richards J,All S,Skopis G,et al.Opposing actions of Per1 and Cry2 in the regulation of Per1 target gene expression in the liver and kidney[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2013,305(7):R735-R747.

[30]Wongchitrat P,Govitrapong P,Phansuwan-Pujito P.The expression of Per1 and Aa-nat genes in the pineal gland of postnatal rats[J].J MedAssoc Thai,2012,95(Suppl 12):S69-S75.

[31]Olbrich D,Dittmar M.The cortisol awakening response is related with PERIOD1 clock gene expression in older women[J].Exp Gerontol,2012,47(7):527-533.

[32]Tong Z,Han C,Qiang M,et al.Age-related formaldehyde interferes with DNA methyltransferase function,causing memory loss in Alzheimer's disease[J].Neurobiol Aging,2015,36 (1):100-110.

Tissue-specific Changes of Clock DNAPromoter Methylation withAging

ZHU Yan-qiu1a,LU Lu1a,LI Lin1a,CAI Yan-ning1b,ZHANG Lan1a
1.a.Department of Pharmacology,b.Department of Neurobiology,Xuanwu Hospital,Capital Medical University, Beijing 100053,China

Objective To investigate the role of the clock gene promoter methylation in aging.Methods C57BL mice of 4-(young,n=9) and 20-(old,n=10)month-old were determined the promoter methylation level of clock genes(Per1/2,Bmal1/2,Cry1/2,Clock,Npas2)in the stomach,spleen,vascular,kidney and striatum with methylation-specific polymerase chain reaction(MSP).Results The incidence of promoter methylation of Cry1,Bmal2 and Npas2 in spleen increased in old mice(P＜0.05),while the promoter methylation of Per1 in stomach decreased(P＜0.05),and the promoter methylation of Bmal1 in vascular increased(P＜0.05).Conclusion Promoter methylation of some clock genes is involved in process of aging in a tissue-specific way.

aging;circadian rhythm;clock genes;promoter methylation

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.05.005

R339.3

A

1006-9771(2015)05-0514-05

2015-02-27

2015-04-07)

1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81473373)；2.北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.7132110)；3.北京市中醫(yī)管理局重點(diǎn)項(xiàng)目(No. KJTS2011-04)；4.北京市新世紀(jì)百千萬(wàn)人才工程項(xiàng)目(No.008-0014)；5.首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)項(xiàng)目(No.首發(fā)2011-1001-05)；6.北京市教委新醫(yī)藥學(xué)科群項(xiàng)目(No.XK100270569)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，a.藥物研究室；b.神經(jīng)生物室，北京市100053。作者簡(jiǎn)介：祝艷秋(1990-)，女，漢族，江蘇泰州市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，抗衰老藥理學(xué)。通訊作者：張?zhí)m(1972-)，女，北京市人，博士，教授，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)、中藥藥理學(xué)、抗衰老藥理學(xué)。E-mail:lanizhg@hotmail.com。