劉金霞，馬原源，劉斌，鄧春穎，李世英

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ與微管相關(guān)蛋白2在血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)

①劉金霞，馬原源，劉斌，鄧春穎，李世英

目的觀察微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(LC3Ⅱ)與微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)在血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)及變化情況。方法48只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組(血管性癡呆模型)，每組大鼠又隨機(jī)分為模型制備成功后1、2、4和8周4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。采用四血管阻斷法制備大鼠血管性癡呆模型。免疫組化法檢測(cè)LC3Ⅱ與MAP-2的表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)LC3Ⅱ表達(dá)均顯著增高(P＜0.001)，MAP-2表達(dá)均顯著減少(P＜0.001)。模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)LC3Ⅱ與MAP-2的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.723,P＜0.001)。結(jié)論LC3Ⅱ蛋白在海馬CA1區(qū)過度表達(dá)，MAP-2蛋白表達(dá)減少，這可能是血管性癡呆發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。

血管性癡呆；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；微管相關(guān)蛋白2；海馬；自噬；大鼠

[本文著錄格式]劉金霞，馬原源，劉斌，等.微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ與微管相關(guān)蛋白2在血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(5):497-500.

CITED AS:Liu JX,Ma YY,Liu B,et al.Expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3 II and microtubule-associated protein 2 in CA1 area of hippocampus of vascular dementia rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(5):497-500.

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是由腦血管疾病導(dǎo)致的腦組織損害，造成腦功能減退的認(rèn)知缺損綜合征，是老年期癡呆的重要病因[1]。隨著腦血管病發(fā)病率的不斷升高，血管性癡呆的發(fā)病率日益增高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2-3]，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。隨著研究的深入，學(xué)者提出了血管性癡呆發(fā)病機(jī)制的相關(guān)觀點(diǎn)[4-6]，但其確切發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚。

自噬是指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，利用溶酶體、自噬泡降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程[7]，被稱為Ⅱ型程序性死亡。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)

是在高等真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第一種自噬體膜蛋白，是自噬的關(guān)鍵蛋白[8]，被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物中自噬活性和自噬體形成，通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ的量或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，可確定細(xì)胞自噬是被誘導(dǎo)還是被抑制狀態(tài)[9]。微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)為微管相關(guān)蛋白家族，可在微管蛋白連接區(qū)連接微管，穩(wěn)定細(xì)胞骨架，參與神經(jīng)元可塑性調(diào)節(jié)，在突觸改變過程中有重要作用[10]，并可穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，傳導(dǎo)信號(hào)，對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用[11]。本研究觀察自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ與MAP-2在血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)，以探討其在血管性癡呆發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，2～3月齡，體重240～260 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2013-0013。在河北聯(lián)合大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫控制在(24±2)℃，自然光照。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。

大鼠編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)生成器隨機(jī)抽取數(shù)字，將大鼠分為假手術(shù)組和模型組，每組再分為造模后1、2、4、8周4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗大鼠LC3Ⅱ多克隆抗體、兔抗大鼠MAP-2多克隆抗體和山羊血清封閉液：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。腦立體定位儀：NARISHIGE公司。Olympus光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS公司。

1.3 模型制備

采用改良Pulsinelli四血管阻斷法(4-VO)制備血管性癡呆大鼠模型[12]。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。模型組用電凝針燒灼雙側(cè)第1頸椎橫突孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，使雙側(cè)椎動(dòng)脈永久性閉塞，然后縫合；分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線備用。24 h后，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，每次夾閉5 min，間隔10 min，反復(fù)夾閉3次。發(fā)生全腦缺血的大鼠可觀察到四肢及尾巴僵硬，甚至出現(xiàn)尾巴向上強(qiáng)直卷曲，翻正反射消失。假手術(shù)組只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈及第1頸椎橫突孔，然后縫合，不進(jìn)行椎動(dòng)脈電凝及頸總動(dòng)脈的夾閉。手術(shù)后，大鼠均予慶大霉素2 mg/kg腹內(nèi)注射3 d，以預(yù)防感染。

1.4 標(biāo)本制備

按預(yù)定時(shí)間點(diǎn)取材。大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，仰臥固定于操作臺(tái)上，劍突下剪開胸腔，充分暴露心臟。將灌注針從心尖插入至左心室并固定針尖位置，然后剪開右心耳，注射生理鹽水約250 ml；待大鼠肝臟無(wú)明顯血色、右心耳流出無(wú)色液體后，灌注4%多聚甲醛約180 ml，可見大鼠肢體抽動(dòng)、尾巴僵直。快速斷腦，迅速剝離腦組織置于盛有多聚甲醛的瓶中，4℃冰箱放置24～36 h后，切取視交叉前后3 mm腦組織脫水、透明、浸蠟、包埋。石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚約3 μm，用經(jīng)泡酸、沖水、烤干、多聚賴氨酸溶液處理后的載玻片撈片，晾干后置于60℃烤箱中24～36 h備用。

1.5 LC3Ⅱ和MAP-2蛋白檢測(cè)

按SP試劑說明書進(jìn)行操作。兔抗大鼠LC3Ⅱ多克隆抗體及兔抗大鼠MAP-2多克隆抗體均稀釋至1∶300。高倍鏡下隨機(jī)選取大鼠海馬CA1區(qū)6個(gè)視野，進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

假手術(shù)組海馬CA1區(qū)各時(shí)間點(diǎn)可見少量LC3Ⅱ蛋白陽(yáng)性表達(dá)。模型組1周時(shí)可見LC3Ⅱ蛋白陽(yáng)性表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，4周達(dá)到高峰，8周開始下降，但仍較高。與假手術(shù)組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)LC3Ⅱ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著增高(P＜0.001)。見表1、圖1。

假手術(shù)組海馬CA1區(qū)各時(shí)間點(diǎn)可見多量MAP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)。模型組1周時(shí)可見MAP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)，4周表達(dá)最高，8周開始下降，但仍較高。與假手術(shù)組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)MAP-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P＜0.001)。見表1、圖2。

模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)LC3Ⅱ與MAP-2蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.723,P＜0.01)。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)各時(shí)間點(diǎn)LC3Ⅱ、MAP-2蛋白表達(dá)(/高倍視野)

圖1 各組海馬CA1區(qū)各時(shí)間點(diǎn)LC3Ⅱ蛋白表達(dá)(免疫組化，400×)

圖2 各組海馬CA1區(qū)各時(shí)間點(diǎn)MAP-2蛋白表達(dá)(免疫組化，400×)

3 討論

血管性癡呆發(fā)病機(jī)制的研究是近年研究的熱點(diǎn)。研究者針對(duì)血管性癡呆的發(fā)病提出血管機(jī)制、膽堿能系統(tǒng)受損機(jī)制、興奮性氨基酸細(xì)胞毒性機(jī)制、炎性反應(yīng)機(jī)制、自由基損傷機(jī)制及突觸可塑性機(jī)制等觀點(diǎn)[13-14]。我們的先前研究表明，自噬參與血管性癡呆的發(fā)生過程[15-16]。自噬是一種由溶酶體介導(dǎo)的降解過程，在維持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的合成、降解平衡和細(xì)胞成分的有序再利用中發(fā)揮重要作用[17]。在營(yíng)養(yǎng)匱乏或疾病狀態(tài)下，自噬可被激活，出現(xiàn)特征性的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。自噬體通過微管系統(tǒng)運(yùn)輸至溶酶體并融合形成自噬溶酶體，進(jìn)行多種酶消化及降解過程，降解產(chǎn)物釋放入胞漿并被細(xì)胞再利用[18]。

LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型。在自噬發(fā)生過程中，Ⅰ型LC3主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)泛素樣加工修飾，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成Ⅱ型LC3并聚集到自噬體膜上[19]。它們?cè)谀ど系暮客ǔ１蛔鳛闇y(cè)定自噬活性的方法[20]。自噬過度激活可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，屬于自噬性細(xì)胞死亡[21]。在血管性癡呆的發(fā)病中，自噬與凋亡共存，且兩者表達(dá)趨勢(shì)一致[22]。本研究結(jié)果顯示，血管性癡呆模型大鼠海馬CA1區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)LC3Ⅱ表達(dá)明顯增加，說明自噬參與血管性癡呆的發(fā)生、發(fā)展過程。

MAP-2是神經(jīng)元的一種骨架蛋白，主要存在于神經(jīng)細(xì)胞的樹突和胞體中。MAP-2作為突觸后的標(biāo)志蛋白，在調(diào)節(jié)突觸可塑性方面起著重要作用[23]。突觸建立后，蛋白磷酸化酶激活和/或蛋白激酶抑制，使MAP-2去磷酸化，MAP-2與微管相連，細(xì)胞骨架穩(wěn)定，保持突觸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[24]。大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后再灌注7 d左右，MAP-2蛋白表達(dá)下降[25]。本研究顯示，血管性癡呆模型大鼠海馬CA1區(qū)各時(shí)間點(diǎn)MAP-2蛋白表達(dá)均低于假手術(shù)組，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[26]。MAP-2在缺血性損傷的表達(dá)下調(diào)，使微管穩(wěn)定性受損，導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)元損傷。MAP-2在血管性癡呆的發(fā)生、發(fā)展過程中也起重要作用。

本研究還顯示，LC3Ⅱ和MAP-2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示自噬可以調(diào)節(jié)病理狀態(tài)下神經(jīng)突觸的可塑性，這可能是血管性癡呆發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。血管性癡呆大鼠發(fā)生自噬的同時(shí)，出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞骨架穩(wěn)定性降低，兩者之間可能存在復(fù)雜的聯(lián)系。對(duì)兩者的深入研究，有助于揭示血管性癡呆發(fā)生發(fā)展過程的內(nèi)在機(jī)制，為血管性癡呆發(fā)病機(jī)制的研究和治療提供新的理論依據(jù)。

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Expression of Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3 II and Microtubule-associated Protein 2 in CA1 Area of Hippocampus of Vascular Dementia Rats

LIU Jin-xia,MA Yuan-yuan,LIU Bin,DENG Chun-ying,LI Shi-ying
First Department of Neurology,theAffiliated Hospital of Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China

Objective To observe the expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3 II(LC3II)and microtubule-associated protein 2(MAP-2)in CA1 area of hippocampus in vascular dementia rats.Methods 48 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group and model group.Meanwhile,each group was further divided into 1,2,4 and 8 weeks subgroups(n=6).Vascular dementia model was established by blocking four vessels.The expressions of LC3II and MAP-2 protein were detected with immunohistochemistry in the CA1 area of hippocampus.Results The expression of LC3II significantly increased,and the expression of MAP-2 decreased in the model group compared with the sham group at every time point(P＜0.001).The expression of LC3II was negatively correlated with MAP-2 at every time point in the model group(r=-0.723,P＜0.05).Conclusion It may play an important role for the occurrence and development of vascular dementia that the expression of LC3II increased and MAP-2 descreased in CA1 area of hippocampus in rats.

vascular dementia;microtubule-associated protein 1 light chain 3;microtubule-associated protein 2;hippocampus;autophagy;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.05.001

R749.1

A

1006-9771(2015)05-0497-04

2015-01-27

2015-02-16)

1.河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No.ZH2012046)；2.河北省重大醫(yī)學(xué)科研課題(No.zd2013087)。

河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北唐山市063000。作者簡(jiǎn)介：劉金霞(1989-)，女，漢族，河北保定市人，碩士研究生，主要研究方向：腦血管病及認(rèn)知障礙。通訊作者：劉斌，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究生導(dǎo)師。E-mail:liubintsh@126.com。