雷 衛(wèi)陳 凰徐學(xué)剛李遠(yuǎn)宏吳 嚴(yán)?

·論著·

白藜蘆醇對(duì)UVA照射人成纖維細(xì)胞的光保護(hù)作用

雷 衛(wèi)1，2陳 凰1，3徐學(xué)剛1李遠(yuǎn)宏1吳 嚴(yán)1?

目的: 明確白藜蘆醇對(duì)長波紫外線(UVA)照射人成纖維細(xì)胞的光保護(hù)作用。方法: 細(xì)胞培養(yǎng)后，分為UVA組、UVA＋0.01 mmol/L白藜蘆醇組、0.01 mmol/L白藜蘆醇組及空白對(duì)照組。采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，ELISA法檢測上清液中白介素(IL)－1β蛋白水平，RT－PCR檢測細(xì)胞中核因子－κB(NF－κB)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)－1，－3的mRNA水平。結(jié)果: 0.01mmol/L白藜蘆醇組可提高UVA照射引起的細(xì)胞增殖活性的降低，降低UVA照射引起的IL－1β蛋白及細(xì)胞NF－κB、MMP－1和MMP－3mRNA的高表達(dá)。結(jié)論: 0.01mmol/L白藜蘆醇可能通過抑制IL－1β和NF－κB及其介導(dǎo)的MMPs表達(dá)，從而抑制UVA照射對(duì)人成纖維細(xì)胞造成的光損傷。

白藜蘆醇； 長波紫外線； 成纖維細(xì)胞

照射到地球表面的紫外線包括95%～98%的UVA和2%～5%的UVB。盡管UVA和UVB照射都會(huì)引起光老化，但UVA的劑量是UVB的10～1000倍，而且UVA照射一般深達(dá)真皮而作用于皮膚成纖維細(xì)胞。1紫外線照射可引起皮膚細(xì)胞的DNA損傷，是各種類型皮膚腫瘤的主要環(huán)境危險(xiǎn)因素。2細(xì)胞核因子－κB(NF－κB)是一種與炎癥有關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，它可被紫外線和炎癥因子激活，誘發(fā)IL－1、TNF－α、基質(zhì)金屬蛋白－1(MMP－1)等的表達(dá)。3UVA直接照射于人成纖維細(xì)胞可誘發(fā)MMP－1和MMP－3基因水平和蛋白水平的高表達(dá)，4，5從而導(dǎo)致膠原蛋白質(zhì)量和數(shù)量的變化。6UVA照射還可誘發(fā)活性氧族(ROS)包括過氧化氫、超氧陰離子、單線態(tài)氧、羥基自由基、一氧化氮等的蓄積。7單線態(tài)氧可誘發(fā)IL－1的產(chǎn)生，8進(jìn)而提高ROS活性，9，10最后誘導(dǎo)MMP－1和MMP－3高表達(dá)。4，11

白藜蘆醇是自然界中的重要多酚類抗氧化劑，具有抗癌活性。12，13在白藜蘆醇化學(xué)防護(hù)過程中，NF－κB、前炎癥因子和MMPs等因子進(jìn)行了不同程度的參與。有研究表明，白藜蘆醇可通過干擾NF－κB活性調(diào)節(jié)人類角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。14體外研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過抑制NF－κB的抑制蛋白(IκB)磷酸化和降解來阻斷IL－1β刺激的人軟骨細(xì)胞NF－κB p65亞單位活性。15體外研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過在mRNA和蛋白水平作用于MMP－1和MMP－3來發(fā)揮其抗炎和抗異化作用。15本研究中，我們將白藜蘆醇加入到UVA照射的人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，檢測與MMPs相關(guān)指標(biāo)mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、DS培養(yǎng)基(DMEM＋10%胎牛血清)；胰蛋白酶(Hyclone公司，日本)；白藜蘆醇(純度＞98%，雅詩蘭黛公司，美國)；ELISA試劑盒(R＆D，美國)；噻唑藍(lán)(MTT)；SSA－01型UVA照射儀(上海希格瑪高技術(shù)有限公司，照射強(qiáng)度3.2 mW/cm2)；550型酶標(biāo)儀(Bio－Ran Laboratories Inc.，Hercules，加拿大)；二氧化碳培養(yǎng)箱(BB16，德國)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取健康人包皮環(huán)切術(shù)后包皮組織，用含雙抗(青霉素100 000 U/L、鏈霉素100 mg/L)的PBS緩沖液漂洗3次，在無菌條件下用眼科剪盡量剔除皮下脂肪組織，剪成0.5 cm×0.5 cm的皮片，加入0.25%的胰蛋白酶4℃消化過夜。次日分離真表皮，將真皮部分剪碎后加入適量0.25%的胰蛋白酶37℃消化5 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，200目尼龍網(wǎng)過濾，過濾后的細(xì)胞1000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱孵育。每3天換液1次，約3天左右可見貼壁的梭形成纖維細(xì)胞，2周左右單層梭形的成纖維細(xì)胞鋪滿瓶底。用0.25%的胰蛋白酶1∶2消化傳代，取第4代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 檢測白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)分為UVA組、UVA＋0.01mmol/L白藜蘆醇組、白藜蘆醇組及空白對(duì)照組。制備5×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔200μL接種于96孔板。UVA組、UVA＋0.01 mmol/L白藜蘆醇組:UVA照射光源與細(xì)胞間距離為15 cm，UVA照射劑量為5 J/cm2，UVA照射時(shí)吸去培養(yǎng)基，加少量PBS緩沖液，照射結(jié)束后吸棄PBS緩沖液，按上述實(shí)驗(yàn)分組即刻加入含終濃度為0、0.01 mmol/L白藜蘆醇(母液為200 mmol/L，二甲基亞砜配制)的DS培養(yǎng)基200μL。白藜蘆醇組:加入含終濃度為0.01 mmol/L白藜蘆醇(母液為200 mmol/L，二甲基亞砜配制)的DS培養(yǎng)基200μL。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)6、24、48、72 h后，采用MTT法檢測:加入MTT液(5 g/L，PBS配制)20μL，繼續(xù)孵育4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入150μL DMSO，避光震蕩10min，直到紫藍(lán)色沉淀完全溶解，于酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取吸光度(A值)。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)組A值－調(diào)零孔A值)/(空白對(duì)照組A值－調(diào)零孔A值)×100%。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測IL－1β分泌量 制備密度為5×104/mL的細(xì)胞懸液，定量接種于6孔板，按上述分組要求處理細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)6、24、48、72 h后收集細(xì)胞上清液，將上清液按照試劑說明書要求加入已包被抗體的96孔板中，于酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取A值。

1.2.4 RT－PCR檢測體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞NF－κB、MMP－1、MMP－3 mRNA水平 細(xì)胞用PBS洗3次，使用RNAisoTMPlus試劑盒提取總RNA。據(jù)逆轉(zhuǎn)錄說明書，根據(jù)總RNA量加入適量的5×PrimeScriptR RTMster Mix及RNase－free水。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件: 37℃15 min，85℃ 5 s，4℃。將所有的樣本濃度調(diào)整至相當(dāng)于RNA濃度30 ng/μL。在含有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR反應(yīng)液中，分別加入NF－κB、MMP－1、MMP－3引物。NF－κB引物:上游引物5'CGCATCCAGACCAACAACAACC－3'，下游引物5'AGAGCCGCACAGCATTCAGG－3'；MMP－1引物:上游引物5'CATGCCATTGAGAAAGCCTTCC－3'，下游引物 5'AGAGTTGTCCCGATGATCTCC－3':MMP－3引物:上游引物5'GACAAAGGATACAACAGGGACCAAT－3'，下游引物 5' TGAGTGAGTG ATAGAGTGGGTACAT－3'；β－actin做內(nèi)參照引物，上游引物5'TGCGTTACACCCTTTCTTG－3'，下游引物5'ACCTTCACCGTTCCAGTTT－3'。PCR反應(yīng)體積為25μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 30 s，循環(huán)條件為:95℃ 10 s、60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描成像擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，多重比較采取SNK檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖率 0.01 mmol/L白藜蘆醇對(duì)正常人成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性無影響。UVA照射后6 h時(shí)細(xì)胞增殖率較空白對(duì)照降低大約10%，24 h時(shí)恢復(fù)至接近正常，48 h和72 h又下降至很低水平。0.01 mmol/L白藜蘆醇加入U(xiǎn)VA照射的細(xì)胞后，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性均得到了很好的保護(hù)(圖1，圖2)。

2.2 細(xì)胞因子IL－1β測定 空白對(duì)照組和白藜蘆醇組的細(xì)胞上清液中IL－1β蛋白水平接近，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。UVA照射后，IL－1β蛋白水平在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上升了近15%(P＜0.05)，48 h時(shí)達(dá)高峰。0.01 mmol/L白藜蘆醇加入U(xiǎn)VA照射的細(xì)胞后，這種高水平又降至正常水平。(圖3)

圖1 MTT檢測細(xì)胞增殖活性

2.3 RT－PCR檢測結(jié)果

圖2 倒置相差顯微鏡下人成纖維細(xì)胞形態(tài)(6 h時(shí))

2.3.1 NF－κB 與空白對(duì)照組和白藜蘆醇組相比，UVA組的NF－κBmRNA表達(dá)在6 h和24 h時(shí)顯著升高約40%(P＜0.05)，48 h進(jìn)一步升高，72 h時(shí)回落至正常水平(P＞0.05)。加入0.01 mmol/L白藜蘆醇后，可在6 h、24 h和48 h逆轉(zhuǎn)上述高表達(dá)。(圖4)

2.3.2 MMP－1和MMP－3 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，空白對(duì)照組和白藜蘆醇組的MMP－1 mRNA和MMP－3 mRNA無明顯差異(P＞0.05)。UVA照射后，這兩個(gè)指標(biāo)的mRNA表達(dá)顯著升高，從6 h至48 h呈現(xiàn)正弦曲線趨勢(高峰在24 h)。其中，MMP－1升高約85%，MMP－3升高約65%。72 h時(shí)，MMP－1 mRNA回落至正常水平，而MMP－3 mRNA反彈至較高水平。經(jīng)0.01 mmol/L白藜蘆醇處理后，MMP－1 mRNA水平在6 h至48 h得到了很好的抑制；而MMP－3 mRNA水平則在24 h至72 h被顯著抑制(P＜0.05)。(圖5)

圖3 ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL－1β蛋白表達(dá)

圖4 RT－PCR檢測細(xì)胞NF－κB mRNA表達(dá)

圖5 RT－PCR檢測細(xì)胞MMP－1mRNA和MMP－3mRNA表達(dá)

3 討論

目前越來越多的研究證實(shí)白藜蘆醇具有光保護(hù)作用，如抑制、延遲或逆轉(zhuǎn)紫外線照射引起的破壞作用。然而，白藜蘆醇存在不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，因?yàn)樗菀邹D(zhuǎn)化成非活性的cis－形式(尤其在接受紫外線照射后更是如此)，16，17且其自由基清除的特性使得它對(duì)于外源性的ROS更敏感。修飾白藜蘆醇結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)白藜蘆醇光保護(hù)作用和穩(wěn)定性，有學(xué)者將白藜蘆醇類似物加入到一種中性洗劑中，其光保護(hù)因子(SPF)和UVA保護(hù)因子均較之前有所增加，在另一項(xiàng)研究中，多酚甲基化有效地阻止了代謝結(jié)合反應(yīng)，從而很大程度地增加了白藜蘆醇的穩(wěn)定性。182007年，有學(xué)者推出了一種新型白藜蘆醇，即三磷酸白藜蘆醇。這種白藜蘆醇在角質(zhì)層酸性磷酸鹽的幫助下，通過滲透入皮膚并且轉(zhuǎn)換成白藜蘆醇原型而有效地傳遞活性復(fù)合物進(jìn)入皮膚組織。19我們的前期研究將這種白藜蘆醇外涂于日光模擬器照射的人體皮膚上，發(fā)現(xiàn)其可通過抑制日曬傷細(xì)胞形成和降低黑素形成來減輕日曬傷和曬黑。20本研究對(duì)此種白藜蘆醇對(duì)UVA照射人成纖維細(xì)胞光保護(hù)作用進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究中，僅給予白黎蘆醇處理的成纖維細(xì)胞與空白對(duì)照組細(xì)胞的增殖活性相近，提示0.01 mmol/L白黎蘆醇對(duì)細(xì)胞無毒性，安全性好。經(jīng)單次5 J/cm2UVA照射后，6 h時(shí)成纖維細(xì)胞的增殖活性即受到抑制，24 h時(shí)回復(fù)到接近正常水平，此后又被抑制。24 h時(shí)的回復(fù)可能是一種反饋機(jī)制在起作用，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)線粒體功能在UVA照射短期內(nèi)會(huì)更加活躍，在此時(shí)間段更多的外源性MTT經(jīng)琥珀酸脫氫酶還原成了不溶性的紫色結(jié)晶物。21但是隨著時(shí)間推移這種作用被UVA后續(xù)破壞作用壓倒，因此細(xì)胞增殖率在24 h以后進(jìn)一步下降，直至72 h仍未能回復(fù)。加入0.01 mmol/L白黎蘆醇至UVA照射的成纖維細(xì)胞后，上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性均得到了很好的保護(hù)。

Gonzales等提出白黎蘆醇和姜黃素可下調(diào)脂肪細(xì)胞TNF－α介導(dǎo)的NF－κB途徑。22Jha的研究亦發(fā)現(xiàn)白黎蘆醇可抑制嚴(yán)重急性胰腺炎患者NF－κB活性及與之密切相關(guān)的細(xì)胞因子IL－1和TNF－α。23Gonzales認(rèn)為抗氧化劑的這種抑制作用可能是通過抑制NF－κB p65亞單位的核遷移和IκB降解而發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致炎癥因子如IL－1β和TNF－α等生成減少。22在我們的研究中，0.01 mmol/L白黎蘆醇于6 h、24 h和48 h顯著抑制了UVA照射誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞NF－κB mRNA高表達(dá)。UVA照射后6 h和24 h上清液中IL－1β蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)，且一直持續(xù)到照射后72 h，0.01 mmol/L白黎蘆醇加入后可顯著抑制這種高表達(dá)。上述結(jié)果提示白黎蘆醇可能通過抑制NF－κB及IL－1β發(fā)揮抵御光損傷的作用，與以往的研究結(jié)果一致。

還有研究表明，IL－1β可上調(diào)脂肪細(xì)胞內(nèi)MMP－1 mRNA和MMP－3 mRNA的表達(dá)，而白黎蘆醇可劑量依賴地抑制TNF－α誘發(fā)的MMP－1和MMP－3產(chǎn)生。24，25SIRT1是一種天然的白黎蘆醇激活劑，可下調(diào)人類真皮成纖維細(xì)胞MMP－1和MMP－3表達(dá)。26我們的研究中，0.01 mmol/L白黎蘆醇顯著地抑制了成纖維細(xì)胞MMP－1 mRNA(6～48 h)和MMP－3 mRNA (24～72 h)的表達(dá)。上述結(jié)果與以往研究結(jié)果均提示白黎蘆醇可能通過抑制IL－1β及與其密切相關(guān)的MMP－1和MMP－3發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，0.01 mmol/L白黎蘆醇通過保護(hù)細(xì)胞增殖活性、下調(diào)IL－1β蛋白分泌、下調(diào)NF－κB、MMP－1及MMP－3 mRNA表達(dá)，逆轉(zhuǎn)UVA照射誘導(dǎo)的人成纖維細(xì)胞光損傷，從而發(fā)揮抗光老化作用。

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(收稿:2014－11－10 修回:2014－11－17)

Protective effects of resveratrol on photo－damage of human fibroblasts induced by UVA

LEIWei，CHEN Huang，XU Xue-gang，et al.Department ofDermatology，No.1 Hospital ofChina Medical U-niversity，Shenyang，110001

Objective:To determine the protective effects of resveratrol on photo－damage of human fibroblasts induced by UVA.M ethods:Human fibroblastswere random ly divided into UVA group，0.01 mmol/L resveratrol group，UVA combined with 0.01mmol/L resveratrol group and blank control group.The proliferation of fibroblastswas detected by MTT.The level of IL－1βprotein was detected by ELISA.The levels ofmRNA expression of NF－κB，MMP－1，－3 weremeasured by RT－PCR.Results:0.01 mmol/L resveratrol increased the level of fibroblasts proliferation which decreased after UVA－induced and decreased the levels of IL－1βprotein，NF－κB and MMP－1，－3mRNA which increased after UVA－induced.Conclusion:Themechanism of the protective of resveratrol on the photo－damage of human fibroblast induced by UVA may be through regulating the expression of IL－1β，NF－κB and MMPs.

resveratrol；UVA；fibroblast

國家自然科學(xué)基金(青年科學(xué)基金項(xiàng)目)(編號(hào):81301388)

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽，110001 2武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(武漢市第一醫(yī)院)皮膚科，武漢，430000 3深圳市天美醫(yī)療美容醫(yī)院激光科，深圳，518000?通信作者