李 莉，李 培

(新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830011)

丙泊酚(propofol)是一速效短效靜脈麻醉藥，又名異丙酚、普魯泊福。由于麻醉效果見效極快、且麻醉后舒適感較好，除應用于麻醉誘導和麻醉維持［1－2］外，還廣泛用于無痛腸鏡、無痛胃鏡檢查以及無痛人工流產(chǎn)術(shù)。測定異丙泊酚血藥濃度，對指導臨床合理用藥具有重要的意義。丙泊酚血藥濃度的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)［1，3－8］、氣 － 質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)［9－10］、液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜(LC－MS/MS)［2］。后兩種方法的靈敏度較高、特異性強、所需樣品量少，但儀器設備較昂貴，難以普及推廣。在高效液相色譜法中，電化學和二極管陣列［6］檢測法國內(nèi)應用較少。目前文獻報道的高效液相色譜法主要有高效液相－紫外檢測法(HPLCUV)［4，7－8］、高 效 液 相 － 熒 光 檢 測 法 (HPLCFlu)［1，3，5］。為適應臨床藥代動力學研究的需要，本實驗室經(jīng)過內(nèi)標、預處理方法和流動相的選擇，研究并建立了用反相高效液相梯度洗脫法測定人血漿中丙泊酚濃度的方法，這是文獻中首次出現(xiàn)梯度洗脫法測定血漿中的丙泊酚濃度。經(jīng)實驗證明，本方法具有較高的精密度和準確度，適用于臨床血藥濃度監(jiān)測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－6AD液相色譜儀(北京超越未來科技發(fā)展有限公司)，ER－128A電子分析天平(A＆DDeompany，TLD，JAPAN);超聲波清洗儀(500 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司);IKA MS3基本型圓周震蕩搖床(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司);TDL－5A菲恰爾離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司);HGC－12A干浴氮氣吹干儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);pH計(梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 藥品與試劑 丙泊酚對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號:100806－200801，ID:4H01－51DP，純度99.8%);卡馬西平片(上海中西三維藥業(yè)有限公司);乙腈(色譜純，SIGMA公司);甲醇(色譜純，SIGMA公司);實驗用水為屈臣氏蒸餾水;磷酸二氫鉀(分析純，天津市福晨化學試劑廠);氫氧化四甲基胺(TMAH，10%，分析純，天津市光復精細化工研究所);異丙醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司);環(huán)己烷(分析純，天津市富宇精細化工有限公司);正丁醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司);三氟乙酸(分析純，天津市福晨化學試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hanbon Science＆.Technology C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:流動相為乙腈/甲醇混合液(乙腈—甲醇按80∶20(V/V)的比例配制，作為有機相)—水(水相加1%的三氟乙酸調(diào)pH值到4)進行二元梯度洗脫，0～7 min(50∶50，V/V)，7 ～9 min(50∶50 ～70∶30，V/V)，9 ～22 min(70∶30，V/V);流速:1.0 mL·min－1;檢測波長:274 nm;進樣量:20 μL;柱溫:40℃。

2.2 溶液配制 (1)丙泊酚標準儲備液的配制:用移液槍精密量取丙泊酚對照品25 μL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得到500.00 mg·L－1丙泊酚標準儲備液。密閉后，于4℃冰箱保存。(2)丙泊酚系列標準溶液的配制:用移液管精密量取500.00 mg·L－1的丙泊酚標準儲備液 12.5 mL 于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為250.00 mg·L－1丙泊酚甲醇溶液。依次逐級稀釋，最后得到 500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg·L－1的系列標準溶液。(3)內(nèi)標液的配制:取卡馬西平片劑20片，精密稱定，研細。精密稱取細粉25 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5 mL置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。(4)磷酸鹽緩沖液的配制:稱量磷酸二氫鉀1.36 g溶于100 mL蒸餾水中，配制成 0.1 mol·L－1。(5)四甲基氫氧化銨固定液的配制:用移液管精密量取10%(W/W)四甲基氫氧化銨溶液4.7 mL于25 mL容量瓶中，用異丙醇稀釋至刻度。

2.3 樣品處理方法 得到的空白全血或含藥全血于3 000 r·min－1低速離心10 min，取上層液即血漿于2 mL離心管中。取空白血漿或含藥血漿1.00 mL于10 mL連蓋離心管中，分別準確加入50 μL內(nèi)標液、l mL 0.1 mol·L－1的磷酸鹽緩沖液，5 mL 環(huán)己烷:正丁醇(95∶5)的混合有機溶液溶液。渦旋振蕩2 min，于 4 000·min－1低速離心 5 min，取上層有機相約4.5 mL移至另一離心管中，精密加入TMAH稀釋液50 μL，渦旋振蕩2 min，40℃氮氣流吹干。精密加入100 μL乙腈溶解殘余物，渦旋振蕩5 min。復溶后，吸取混合液過0.22 μm的濾膜后，精密吸取 20 μL，進樣分析。

2.4 專屬性試驗 取空白血漿1 mL置10 mL連蓋離心管中，除不加內(nèi)標外，按“2.3”項下方法操作，獲得空白血漿樣品的色譜圖，如圖1A;將一定濃度的丙泊酚標準溶液和內(nèi)標溶液混合液進樣分析，得色譜圖1B;將此混合液加入空白血漿中，按“2.3”項下方法操作，得色譜圖1C。內(nèi)標物和標準品的出峰時間分別為6.2 min和20.8 min;取麻醉手術(shù)患者靜注丙泊酚 (得普利麻，英國阿斯利康公司)后收集的血漿樣品，按照“2.3”項下方法操作，得色譜圖1D。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾丙泊酚及內(nèi)標的測定，本方法具有較高的專屬性。

2.5 標準曲線的制備 在10 mL的連蓋離心管中分別加入950 μL空白血漿，再加入丙泊酚系列濃度標準溶液50 uL，使血藥濃度相當于 25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.098 mg·L－1。按“2.3”項下方法操作，以丙泊酚峰面積與內(nèi)標峰面積的比值X為橫坐標，丙泊酚的血藥濃度C為縱坐標進行線性回歸，求得回歸方程為C=1.5975X－0.0294(r=0.999 8)。

丙泊酚的血藥濃度在0.098～25 mg·L－1范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。丙泊酚的定量下限為0.098 mg·L－1(S/N=3)。

2.6 精密度及回收率 在950 μL空白血漿中分別加入低、中、高3種濃度的丙泊酚標準溶液50 μL，使其濃度分別為0.20，1.56，12.50 mg·L－1，每種濃度6份，按“2.3”項下方法操作，將丙泊酚峰面積與內(nèi)標峰面積之比X代入標準曲線計算丙泊酚血藥濃度，以測得值與加入值之比計算方法回收率。以1 d內(nèi)測得的丙泊酚血藥濃度計算日內(nèi)精密度，以連續(xù)測定3 d，每天1次測得的丙泊酚濃度計算日間精密度。結(jié)果見表1。

表1 丙泊酚回收率與日內(nèi)、日間精密度(±s)

表1 丙泊酚回收率與日內(nèi)、日間精密度(±s)

加入量/mg·L－1測得量/mg·L－1 RSD/%相對回收率/%日內(nèi)0.20 0.18 ±0.089 5.05 89.68 ±0.049 1.56 1.55 ±0.016 1.13 98.84 ±0.011 12.50 12.23 ±0.40 3.25 98.99 ±0.022日間 0.20 0.17 ±0.013 7.43 89.33 ±0.031 1.56 1.61 ±0.018 1.09 102.98 ±0.011 12.50 11.75 ±0.68 5.79 93.98 ±0.029

3 討論

3.1 內(nèi)標的選擇 文獻報道多采用麝香草酚藍［1，5－7，9］為內(nèi)標物，偶見 2，4 － 二叔丁基苯酚［3］、卡馬西平［8］、乙基罌粟堿［10］等做內(nèi)標。本實驗最初選取麝香草酚藍作為內(nèi)標，但是通過調(diào)整流動相比例、更換流動相等色譜條件不能實現(xiàn)同時將內(nèi)標物、丙泊酚、血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)分離的目標。經(jīng)過嘗試，最終選取卡馬西平作為內(nèi)標。

3.2 樣品預處理方法的選擇 文獻報道的丙泊酚血樣的預處理方法主要有液液萃取法［4，7，9］和蛋白沉淀法［5－6］。本實驗分別嘗試了用甲醇、乙腈及二者的混合液作為沉淀劑沉淀蛋白，但發(fā)現(xiàn)回收率偏低。在液液萃取方面，嘗試了用環(huán)己烷［4］、環(huán)己烷:正丁醇(95∶5)混合液［7］、氯仿—乙酸乙酯混合液［9］，最終確定萃取劑為環(huán)己烷:正丁醇(95∶5)的混合有機溶液溶液。

3.3 流動相的選擇 文獻報道的流動相組成有乙腈∶水(60∶40，pH2.3)［1］、乙腈∶水(69∶31，pH 4.0)［3］、甲醇∶水(75∶25)［4］、乙腈∶水(65∶36)［5］、乙腈:0.01 mol·L－1磷酸二氫鉀水溶液(70∶30，磷酸調(diào) pH 值到 4)［6］、乙腈∶水(70∶30，其中水相加 1%的三氟乙酸調(diào) pH 值到 4)［7］、甲醇∶水(68∶32)［8］等。文獻報道的均為等度洗脫，本實驗原本使用的流動相是乙腈∶水(其中水相加1%的三氟乙酸調(diào)pH值到4)進行等度洗脫，但是不論怎樣調(diào)整流動相比例，均無法獲得良好的分離效果。當有機相比例較高(超過50%)時，血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)和內(nèi)標集中在前5 min出峰，不能將內(nèi)標物與血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)分開;降低有機相比例雖能將內(nèi)標物、丙泊酚、血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)分開，然而此時丙泊酚出峰時間太長(超過30 min)。經(jīng)過反復的摸索和嘗試，最終確定流動相為乙腈/甲醇混合液(乙腈—甲醇按80∶20(V/V)的比例配制，作為有機相)—水(水相加1%的三氟乙酸調(diào)pH值到4)，進行二元梯度洗脫，0 ～7 min(50∶50，V/V)，7 ～9 min(50∶50 ～70∶30，V/V)，9 ～22 min(70∶30，V/V)，在低濃度條件下也可獲得較好的洗脫效果，內(nèi)標和藥物出峰時間合理，色譜峰形理想。這是文獻中首次出現(xiàn)梯度洗脫法測定血漿中的丙泊酚濃度。本方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，可以滿足丙泊酚臨床藥動學研究的需要。

［1］Bienert AZ，Zaba S，Dyderski M，et al.Long-term stability of propofol in human plasma and blood in different storage conditions［J］.Acta Poloniae Pharmaceutica，2005，62:95 －97.

［2］Cohen SF，Lhuillier Y，Mouloua B，et al.Quantitative measurement of propofol and in main glucuroconjugate metabolites in human plasma using solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2007，854:165－172.

［3］Yarbrough JR，Harvey M，Cox S.Determination of propofol using high performance liquid chromatography in whole blood with fluorescence detection［J］.Journal of Chromatographic Science，2012，50:162 －166.

［4］Dawidowicz AL，Kalitynski R.HPLC investigation of free and bound propofol in human plasma and cerebrospinal fluid［J］.Biomedical Chromatography，2003，17:447 －452.

［5］Cussonneau XE，De Smet K，Lantsoght J，et al.A rapid and simple HPLC method for the analysis of propofol in biological fluids［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，44:680－682.

［6］張惠君，王 彥，唐芳麗.RP-HPLC法測定人血漿中的丙泊酚濃度［J］.中國藥房，2011，22(22):2054 －2056.

［7］李 莉.光纖傳感—分子印跡—熒光分析法在線監(jiān)測異丙酚濃度的研究［D］.烏魯木齊:新疆醫(yī)科大學，2007.

［8］王增壽，金勝威.反相高效液相色譜法測定異丙酚血清濃度［J］.中國臨床藥學雜志，2001，10(3):175 －177.

［9］Klausz GK，Rona I，Kristof，et al.Evaluation of a fatal propofol intoxication due to self administration［J］.Journal of Forensic and Legal Medicine，2009，16(5):287 －289.

［10］Colucci A，Gagliano-Candela L，Aventaggiato D，et al.Suicide by selfadministration of a drug mixture(propofol，midazolam，and zolpidem)in an anesthesiologist:The first case report in Italy［J］.Journal of Forensic Sciences，2013，58(3):837 －841.