朱 勤，劉 驊，武 谷

(安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽合肥 230051)

一次性使用無(wú)菌注射器是臨床上廣泛使用的醫(yī)療器械，與血液或人體直接接觸，是屬于國(guó)家重點(diǎn)監(jiān)管的醫(yī)療器械產(chǎn)品之一，與人民醫(yī)療健康息息相關(guān)。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一類(lèi)在離體狀態(tài)下模擬生物體生長(zhǎng)環(huán)境，檢測(cè)材料和器械接觸機(jī)體組織后生物學(xué)反應(yīng)的試驗(yàn)，是生物學(xué)評(píng)價(jià)體系中重要的檢測(cè)指標(biāo)之一［1］。在對(duì)2010年國(guó)家監(jiān)督抽驗(yàn)的8個(gè)廠家40批次的一次性使用無(wú)菌注射器的生物安全評(píng)價(jià)中，按照GB/T14233.2-2005的檢測(cè)方法增加了體外細(xì)胞毒性［2］的評(píng)價(jià)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與儀器

超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司 HS-1300)、CO2培養(yǎng)箱(三洋 MCO-15AC)、酶標(biāo)儀(美國(guó)基因公司MQX200R)、倒置顯微鏡(日本尼康)、小鼠成纖維細(xì)胞L-929(購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))、RPMI-1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)、小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)、胰酶(北京賽馳生物科技有限公司)、MTT(Sigma公司)。陰性對(duì)照為高密度聚乙烯，陽(yáng)性對(duì)照為5% 二甲基亞砜(DMSO)溶液，一次性使用無(wú)菌注射器來(lái)源于國(guó)家監(jiān)督抽驗(yàn)(8個(gè)廠家，2個(gè)規(guī)格共40批，分別標(biāo)記為A、B……H廠家)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備［2］

2.1.1 注射針 在無(wú)菌條件下，按照0.2 g·mL－1浸提比例，稱(chēng)取注射針4 g，加入浸提介質(zhì)(含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基)20 mL，密封后，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h。

2.1.2 注射器 在無(wú)菌條件下，取同一批號(hào)注射器3支，抽取浸提介質(zhì)至最大刻度線處，置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h。

2.2 試驗(yàn)步驟 按照 GB/T14233.2-2005中浸提方法用顯微鏡觀察法和MTT法同時(shí)對(duì)注射針和注射器分離檢測(cè)［4－5］。

2.2.1 顯微鏡觀察法 將已培養(yǎng)24～48 h生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞消化后用含10%小牛血清的培養(yǎng)液配成1×105·mL－1的細(xì)胞懸液接種于直徑35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿2 mL。置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)液?？瞻讓?duì)照組加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組加入陰性對(duì)照品浸提液，陽(yáng)性對(duì)照組加入陽(yáng)性對(duì)照溶液，每皿各加2 mL，每組平行操作3皿，置5%CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h后置顯微鏡下觀察，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定判定毒性反應(yīng)級(jí)別(見(jiàn)表1)。

2.2.2 MTT 法［6－8］將已培養(yǎng)24 ～48 h 生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞消化后用含10%小牛血清的培養(yǎng)液配成1×104·mL－1的細(xì)胞懸液接種96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)液?？瞻讓?duì)照組加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組加入陰性對(duì)照品浸提液，陽(yáng)性對(duì)照組加入陽(yáng)性對(duì)照溶液，每組各設(shè)至少6孔，每孔各加100 μL，置5%CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h后置顯微鏡下觀察，再每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g·L－1的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，在酶標(biāo)儀570 nm和630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，按公式計(jì)算相對(duì)增殖率(RGR)［9］，RGR=(供試品組吸光度/空白對(duì)照組吸光度)×100%，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定判定毒性反應(yīng)級(jí)別。

表1 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)

2.3 結(jié)果 8個(gè)廠家40批次一次性使用注射器檢測(cè)結(jié)果如表2所示。由表2可見(jiàn)，40批注射針的體外細(xì)胞毒性均符合要求，但是40批注射器的體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)中有75%產(chǎn)品符合要求，25%的產(chǎn)品細(xì)胞毒性較大，不符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

表2 各廠家批次規(guī)格注射針和注射器檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本次試驗(yàn)涉及8個(gè)廠家共計(jì)40批次的樣品量，檢測(cè)結(jié)果顯示注射針全部符合標(biāo)準(zhǔn)要求，沒(méi)有體外細(xì)胞毒性，有25%注射器有明顯的體外細(xì)胞毒性，且不同規(guī)格均有產(chǎn)品有體外細(xì)胞毒性，本次抽驗(yàn)量中5 mL規(guī)格批次較多，在同規(guī)格中檢測(cè)結(jié)果不合格比率為19%，1 mL規(guī)格批次較少，但是在同規(guī)格中檢測(cè)結(jié)果不合格比率達(dá)到33%，提示今后抽樣和檢測(cè)需要更加關(guān)注1 mL規(guī)格的注射器品種，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示如表3，4。

表3 各廠家合格與不合格批次統(tǒng)計(jì)

表4 出現(xiàn)不合格批次廠家規(guī)格分析統(tǒng)計(jì)

本次試驗(yàn)的8個(gè)廠家中有兩個(gè)廠家為國(guó)外品牌，均未顯示細(xì)胞毒性，但是由于抽樣量較少，無(wú)法體現(xiàn)絕對(duì)的參比意義。國(guó)內(nèi)品牌中抽樣量也不均一，所以建議在今后的監(jiān)督抽驗(yàn)中，能夠擴(kuò)大抽樣量和抽樣范圍，盡可能覆蓋臨床所使用的各種型號(hào)和品牌。同時(shí)體外細(xì)胞毒性的檢測(cè)結(jié)果提示生物安全性試驗(yàn)內(nèi)容有必要進(jìn)行擴(kuò)充。

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)符合3R原則，更加有效靈敏并在減少動(dòng)物損傷的前提下，提供生物安全隱患的參考。而一次性使用無(wú)菌注射器在臨床治療中廣泛使用，因?yàn)樯婕暗襟w內(nèi)給藥，有創(chuàng)傷性和開(kāi)放性以及與血液、體液的直接接觸性，所以對(duì)于此類(lèi)醫(yī)療器械的質(zhì)量安全控制尤其需要重視和加強(qiáng)，目前臨床醫(yī)療事故的發(fā)生不能排除醫(yī)療器械的潛在危害性未被及時(shí)準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)，針對(duì)患者的生命安全保障的考慮，急需研究更多有效的試驗(yàn)方法來(lái)考察和更嚴(yán)格有效的控制一次性無(wú)菌注射器的生物安全。在本次國(guó)評(píng)抽驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了部分產(chǎn)品存在體外細(xì)胞毒性，也有相關(guān)醫(yī)療問(wèn)題曝光，所以建議進(jìn)一步探索產(chǎn)生體外細(xì)胞毒性的原因，避免今后企業(yè)在生產(chǎn)中出現(xiàn)問(wèn)題［10］。

［1］郝和平.醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施指南［M］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000:100－101.

［2］何金花，黎毓光，張 鵬，等.原花青素聯(lián)合Apollon siRNA抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(4):552 －555.

［3］梁福貴，羅軍強(qiáng)，梁漢昌.燈盞花素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和正常肝細(xì)胞LO-2的體外增殖抑制作用［J］.安徽醫(yī)藥，2012，16(10):1423－1424.

［4］GB/T16886.12-2005，醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第12部分:樣品制備與參照樣品.

［5］GB/T14233.2-2005，醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第2部分:生物學(xué)試驗(yàn)方法.

［6］胡靜娜.噻唑藍(lán)法測(cè)定香菇多糖體外對(duì)癌細(xì)胞毒作用［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32(4):464 －466.

［7］高靜賢，王莎莎，金 夢(mèng)，等.醫(yī)用超聲耦合劑體外細(xì)胞毒性檢測(cè)的探討［J］.中國(guó)醫(yī)療器械雜志，2013(3):210－212.

［8］嚴(yán)曉鶯，陳巨鵬，王明艷.MTT法檢測(cè)沒(méi)食子酸對(duì)兩種細(xì)胞的體外毒性［J］.中醫(yī)藥信息，2012，29(2):107 －109.

［9］趙 斌，葛金芳，朱娟娟.小議在MTT法測(cè)細(xì)胞增殖抑制率中IC50的計(jì)算方法［J］.安徽醫(yī)藥，2007，11(9):834 －836.

［10］伍會(huì)燦.國(guó)內(nèi)一次性使用無(wú)菌輸注器械市場(chǎng)現(xiàn)狀及其發(fā)展趨勢(shì)［J］.中國(guó)醫(yī)療器械信息，2012，18(1):55 －57.