過 林，裘福榮，王猛猛，賀 敏，蔣 健

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院臨床藥理科，上海 201203)

雙氯芬酸鈉是芳基乙酸類非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥，其作用機制為抑制環(huán)氧化酶活性，從而阻斷花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，具有較強的抗風(fēng)濕、消炎、鎮(zhèn)痛和退熱作用，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。其特點是劑量小，起效快，不良反應(yīng)少，且耐受性好，長期應(yīng)用無蓄積作用。

文獻中現(xiàn)有一些關(guān)于雙氯芬酸體內(nèi)的分析檢測方法報道［1－5］，判定測量結(jié)果的準(zhǔn)確與否，主要是通過測量誤差來表示。近些年，國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局和中國實驗室國家認(rèn)可委員會相繼制定了《測量不確定度評定與表示》《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》等技術(shù)規(guī)范，說明不確定度作為測量的重要評定方法，已經(jīng)越來越受到重視。目前不確定度評價研究也越來越多［6－11］，它能夠更客觀、準(zhǔn)確的評價測定結(jié)果的質(zhì)量。新藥臨床藥動學(xué)和生物等效性研究需進行大量的生物樣品檢測工作，當(dāng)使用這些分析結(jié)果作為決策依據(jù)時，結(jié)果的可靠性直接決定了新藥的安全性及有效性，而該方面進行不確定度評價的研究相對較少［8－11］，究其原因，主要是生物樣本基質(zhì)復(fù)雜，處理步驟繁多，結(jié)果變異的相關(guān)因素多，因此其不確定度評定較為困難。本文建立了液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定人血漿中雙氯芬酸鈉濃度的方法，并對測定的不確定度進行了評定，為藥動學(xué)研究中進行測量不確定度的評定提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

4000 Q－trap型LC-MS/MS(美國Applied Biosystems公司)，AB135－S型十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒公司);Allegra型高速離心機(Beckman公司)，VX2E型振蕩器(德國IKA公司)。雙氯芬酸鈉(批號100334－200302，純度100%，中國藥品生物制品檢定所)，內(nèi)標(biāo)4－羥基甲苯磺丁脲(批號0001407794，純度100%，美國Sigma公司)，乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)，甲酸、醋酸銨(分析純，中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，超純水為Milli－Q型純水系統(tǒng)制備，健康人空白血漿(上海曙光醫(yī)院I期病房提供)。

2 實驗方法

2.1 分析條件 色譜條件:色譜柱選用Agilent C18(150 mm ×4.6 mm 5 μm)，流動相由乙腈—水(含4 mmol乙酸銨，0.08% 甲酸)(75∶25，V/V)，流速為0.8 mL·min－1，柱溫 20℃，進樣體積為 5 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，氣簾氣(CUR)壓力為20 psi，噴霧氣(GS1)壓力為55 psi，干燥氣(GS2)壓力為55 psi，源噴射電壓(IS)為－4 000 V，離子源溫度(TEM)為400℃。雙氯芬酸及內(nèi)標(biāo)的掃描離子反應(yīng)(MRM)分別為 293.6→249.9、284.9→185.9，碰撞能量(CE)分別為 －14.8、－23.8 V。

2.2 對照品工作液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精確稱取雙氯芬酸鈉對照品11.07 mg(相當(dāng)于雙氯芬酸10.27 mg)，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈定容，即得濃度為1.027 g·L－1雙氯芬酸儲備液。接著，用移液器(量程50 ～200 μL、200 ～1 000 μL)吸取乙腈稀釋儲備液，配制雙氯芬酸系列工作液(L1～L8)，過程見表1。

表1 雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

精確稱取4－羥基甲苯磺丁脲對照品2.10 mg，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈定容，即得濃度為0.210 g·L－1的4－羥基甲苯磺丁脲儲備液。再以乙腈稀釋成濃度為4.2 μg·L－1的內(nèi)標(biāo)乙腈溶液。

2.3 含藥標(biāo)準(zhǔn)血漿的配制 用移液器(量程2～20 μL)分別吸取5 μL系列濃度的雙氯芬酸工作液(L2～L8)于1.5 mL EP離心管中，然后用移液器(量程 50 ～200 μL)分別加入人空白血漿 95 μL，渦旋30 s混勻，配制成雙氯芬酸濃度分別為1.0、5.0、20.0、50.0、200、500 和 2 000 μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本。

按上述方法配制2.0、50.0 和1 600 μg·L－1的含藥標(biāo)準(zhǔn)血漿，分別作為低、中、高(L、M、H)濃度質(zhì)控樣品，進行方法的精密度和回收率考察。

2.4 血漿樣品處理方法 采用蛋白沉淀法處理血漿樣品。用移液器(量程50～200 μL)吸取100 μL血漿樣品，加入 300 μL(量程 200 ～1 000 μL)內(nèi)標(biāo)乙腈溶液，渦旋振蕩3 min，經(jīng)16 000 rpm離心5 min后，取上清液16 000 rpm再次離心5 min，吸取上清液進樣。

2.5 數(shù)學(xué)模型及不確定度的來源分析 標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=bC+a其中:C為雙氯芬酸的濃度(μg·L－1);b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;y=As/Ai;As為雙氯芬酸峰面積響應(yīng)值;Ai為內(nèi)標(biāo)峰面積響應(yīng)值。所以，數(shù)學(xué)模型為C=(y－a)/b+d1+d2+…公式中，d1、d2為對不確定度有貢獻的影響因素，主要為:(1)雙氯芬酸樣品檢測精密度;(2)雙氯芬酸儲備液和系列工作液的配制:包括天平稱量、容量瓶允差和移液器允差等;(3)血漿樣品的配制和提取;(4)回收率;(5)LC-MS/MS儀器測定;(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合;(7)溫度等。這些步驟中的每個因素都會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響，因此都是引入的不確定度的來源。

3 結(jié)果

不確定度分量可分為A類和B類。A類不確定度是由統(tǒng)計確定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，B類不確定度是用非統(tǒng)計方法確定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量。

3.1 A類不確定度評定 由重復(fù)測量(精密度)引入的不確定度ur(1)。配制低、中、高三濃度質(zhì)量樣品，每批每一濃度配制5份(n=5)，共做3批，分別在3 d內(nèi)進行LC-MS/MS測定，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品的濃度，結(jié)果見表2。

計算合并樣本偏差:

式中k為每組平行測定份數(shù)(n=5)，j為組數(shù)(m=3)，G 為組別(L，M，H)。經(jīng)計算，Sp(C，L)=0.182 μg·L－1，Sp(C，M)=2.47 μg·L－1，Sp(C，H)=70.8 μg·L－1。以平均值計算標(biāo)準(zhǔn)偏差的公式為經(jīng)計算0.0471 μg·L－1637 μg·L－1，Sp18.3 μg·L－1。

表2 雙氯芬酸重復(fù)測定濃度數(shù)據(jù)

測量結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur1，()G=經(jīng)計算，u(1，L)=0.0239，u(1，M)rr=0.0136，ur(1，H)=0.0122。

3.2 B類不確定度評定

3.2.1 稱量引入的不確定度，ur(2) 用十萬分之一的電子天平分別稱取雙氯芬酸鈉和內(nèi)標(biāo)。稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(2)u(Δ)為天平非線性誤差引起的標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度，u(Δ0)為天平調(diào)零引起的標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度。依據(jù)計量檢定證書，本實驗所用電子天平的天平分度為e=0.01 mg。按均勻考慮，天平的標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為:u(Δ)==0.002 9 mg。

天平自動調(diào)零作為一次扣皮，其a0=a，則天平自動調(diào)零引起的誤差為:u(Δ0)=0.0029 mg。不考慮重復(fù)性誤差時，稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:u(2)mg。因此，稱量雙氯芬酸的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur(2)=

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度，ur(3) 配制儲備液所用容量瓶為10 mL容量瓶，其最大允許誤差為±0.020 mL。實驗室由空調(diào)控制，保持恒溫恒濕，且供試品溶液和對照品溶液配制時環(huán)境條件相同，容量瓶等精密玻璃量器和溶劑的膨脹系數(shù)都相同，故可忽略由溫度引起的相對不確定度。按均勻分布，容量瓶相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:ur(x，p)=15，p為量程。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制用到的移液器均為Glison移液器，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時用到量程有:p1:200～1 000 μL，p2:50 ～200 μL，p3:2 ～20 μL;按廠商提供的技術(shù)參數(shù)，各移液器的允許誤差分別為 ±8 μL，±1.6 μL ，±0.20 μL;由于溫度對于移液管影響較小，忽略不計。按均勻分布，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中用到1次10 mL容量瓶、2次量程50 ～200 μL 的移液器(其中97 μL 1 次、200 μL 1次)、14次量程200～1000 μL的移液器(其中903 μL 1 次、800 μL 1 次、750 μL 3 次，600 μL 3次、400 μL3 次、250 μL3 次)，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

3.2.3 配制含藥血漿時引入的不確定度，ur(4)在EP管中加入人空白血漿95 μL和5 μL系列濃度的雙氯芬酸工作液，混勻，不確定度主要由移液器引起。配制血漿標(biāo)準(zhǔn)液所用移液器量程有:50～200 μL，2 ～ 20 μL。由于溫度對定容的影響非常小，忽略不計。因此，配制血漿溶液時的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

3.2.4 血漿樣品蛋白沉淀過程引入的不確定度，ur(5) 配制低、中和高濃度質(zhì)控樣品各5份，蛋白沉淀處理后進樣，得到峰面積為B;按照相同方法配制低、中和高濃度的乙腈溶液樣品各3份，進樣后得到的峰面積為A，雙氯芬酸的回收率=B/A ×100%。結(jié)果，低、中和高濃度質(zhì)控樣品平均回收率分別為(94.90 ± 6.34)%，(100.74 ± 6.01)%，(94.99±3.46)%。回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:u其中為回收率各組別的偏差為回收率各組別的均值。因此，

3.2.5 儀器量化引入的不確定度ur(6) 所用AB 4000 Q－trap型號的儀器，其定量的最大允差為3%，按均勻分布，其相對不確定度為:

3.2.6 線性回歸過程引入的不確定度ur(7) 生物樣本中藥物測定時需要先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到未知樣品的濃度，直線回歸是最常用且最簡單的一種，回歸方程的建立對計算未知樣品的濃度至關(guān)重要。制標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本，以y=As/Ai計算不同濃度的y值(見表3)，共擬和3條標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，其平均斜率a=0.0434，截距b=0.0173。

表3 雙氯芬酸與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(n=3)

剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差為:

自相關(guān)方差:

公式中P測定質(zhì)控樣本的總次數(shù)(P=15);N測定標(biāo)曲樣本的總次數(shù)(N=i×j=7×3=21);i為標(biāo)曲血漿樣本的序數(shù)(i=7);j為標(biāo)曲每個濃度血漿樣本測定次數(shù)(j=3);每組標(biāo)曲血漿樣本濃度的平均值;Ci第i個標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液的濃度;G為組別(L、M、H)。

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:ur(7，G)=ur(C，G)

3.3 合成不確定度的評定 雙氯芬酸濃度測定的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

因此，uc，r，L=0.376，uc，r，M=0.039 7，uc，r，H=0.029 2。

低、中和高濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:

3.4 擴展不確定度的評定 由于生物樣品檢測過程比較復(fù)雜，涉及不確定度分量較多，因此可估計為正態(tài)分布，包含因子取k=2，此時對應(yīng)的置信概率為95%，雙氯芬酸的濃度測定的擴展不確定度為:

人血漿中低、中和高濃度質(zhì)控樣品中雙氯芬酸的濃度可分別表示為(1.97 ± 1.482)、(46.97 ±3.72)、(1494 ± 87.2)μg·L－1，k=2(95% 的置信區(qū)間)。

4 討論

隨著國內(nèi)外分析檢測手段的豐富，檢測標(biāo)準(zhǔn)在不斷提高，對分析結(jié)果的評定也越來越標(biāo)準(zhǔn)化、科學(xué)化，不確定度評定檢測方法也越來越重要。中國合格評定認(rèn)可委員會對檢測實驗室進行認(rèn)可時，也要求開展測量不確定度的評定。由于生物樣本基質(zhì)復(fù)雜，樣本濃度很低，檢測過程繁瑣，目前有關(guān)測定生物樣本中藥物濃度不確定度評定的文獻相當(dāng)有限，不確定度評定也并未如方法學(xué)驗證那樣具有公認(rèn)和指導(dǎo)性的方法。本文以人血漿中雙氯芬酸濃度測定為模板，建立相關(guān)不確定度分析方法。

本文按照實驗的順序逐步尋找人血漿中雙氯芬酸濃度測定過程的不確定度的來源，重點考查了測量重復(fù)性(精密度)、稱量對照品、配制標(biāo)準(zhǔn)溶液、配制標(biāo)準(zhǔn)血漿、回收率、儀器量化、線性回歸等因素。在本方法不確定度評定中，由擴展不確定度可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合過程對不確定影響的貢獻最大，其次是回收率，尤其是對低濃度而言。究其原因，主要是由于在藥代動力學(xué)研究中，生物樣本待測物含量極低，標(biāo)曲的最低濃度非常小，在本實驗中最低濃度僅1 μg·L－1，因此相對誤差被放大，操作過程中的任何微小誤差都會造成很大的影響，并且標(biāo)曲最低點溶液的配制經(jīng)過多步稀釋，誤差經(jīng)多次累積。在藥代動力學(xué)研究中進行標(biāo)曲擬合時，通常都使用了加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進行回歸運算，注重了低濃度點的擬合的準(zhǔn)確性，但曲線中高濃度點在剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差評定時，對低濃度點的不確定度影響會很大。同時，本實驗方法學(xué)考察的標(biāo)曲是3個分析批的標(biāo)曲，分3 d配制并測定，而部分文獻［8－10］采用的方法是同一標(biāo)曲連續(xù)進樣3次來考察。因此，標(biāo)準(zhǔn)血漿配制、固相萃取、儀器響應(yīng)波動等因素均會疊加影響不確定度，造成標(biāo)曲擬合對不確定度的影響最大。

通過對LC-MS/MS法測定血漿中雙氯芬酸濃度的測量不確定度評定，為合理改進分析方法，將檢測誤差降至最小提供了可靠依據(jù)。對于影響較大的因素，在測量過程中應(yīng)加以關(guān)注，并且將這些不確定度分量較大的步驟細(xì)化，找出影響因素，提供解決辦法。在日常工作中，對一些步驟可加以關(guān)注。例如配制溶液盡可能使用同一規(guī)格的量器、選用精密的量器和儀器、血漿前處理方法盡可能簡單重現(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合尤其要注意低濃度的樣品等等。通過減小測量結(jié)果的不確定度，使測定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，為建立檢測方法提供科學(xué)指導(dǎo)。在臨床藥代動力學(xué)研究中，如何結(jié)合自身特點，建立的評定方法如何全面準(zhǔn)確的反映分析過程中的影響因素，客觀評價不確定度的結(jié)果，建立公認(rèn)和指導(dǎo)性的方法以及評判標(biāo)準(zhǔn)，都需要作進一步的探索。

［1］Victoria O，Marta IB，Bozo Z，et al.Simultaneous determination of diclofenac，its human metabolites and microbial nitration/nitrosation transformation products in wastewaters by liquid chromatography/quadrupole － linear ion trap mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2014，1347:63 －71.

［2］彭向東，周 淦，周宏灝，等.雙氯芬酸鈉緩釋片在健康人體的藥代動力學(xué)和生物等效性［J］.中國新藥雜志，2011，20(20):2005－2009.

［3］張永剛，董 吉，繆麗燕.UPLC-MS/MS法測定人血漿中雙氯芬酸鈉及其代謝物的濃度［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2013，29(12):948－950.

［4］李冬艷，丁水平，陳小梅，等.超快速液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測定人血漿中雙氯芬酸鈉的濃度［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31(18):1507－1510.

［5］項苗苗，周 臻，丁存剛，等.雙氯芬酸依泊胺凝膠在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44(1):56 －59.

［6］楊錫祥，楊建林.鹽酸嗎啉胍含量測定不確定度評估［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(10):1676 －1678.

［7］左登平.HPLC法測定鹽酸林可霉素注射液含量的不確定度分析［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(11):1871 －1873.

［8］吳國蘭，徐起揚，申屠建中，等.LC-MS/MS法測定人血漿中培美曲塞濃度的不確定度評定［J］.藥物分析雜志，2013，33(4):678－683.

［9］嚴(yán) 蓓，楊 晨，李 揚，等.HPLC法測定人血漿中奧硝唑濃度的不確定度評定［J］.藥物分析雜志，2011，31(9):1797－1803.

［10］劉 一，楊 靜，李 娜，等.液－質(zhì)聯(lián)用測定人血漿中己烯雌酚濃度的不確定度分析［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33(3):187－192.

［11］楊 靜，丁莉坤，王 釗，等.液質(zhì)聯(lián)用法測定人血漿中來曲哇濃度的不確定度評定［J］.中國藥師，2012，15(12):1688 －1692.