陳肖東，蘇 峰，畢東輝，桂雙英，何廣衛(wèi)

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230031;2.合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，安徽合肥 230088)

癲癇是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是由大腦神經(jīng)細胞異常放電導(dǎo)致的突發(fā)性、反復(fù)性和短暫性的大腦功能失調(diào)。世界衛(wèi)生組織 (WHO)估計全世界大約有5 000多萬患者，我國癲癇發(fā)病率約為1‰，患病率約為5‰［1］。癲癇的反復(fù)發(fā)作對家庭和社會都造成極大的負擔和危害。

雙丙戊酸鈉(Divalproex Sodium)是目前抗癲癇治療的一線藥物。藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)它對各種癲癇的實驗?zāi)Ｐ?(全身性和部分性)均有抗驚厥作用。對人的各種類型癲癇發(fā)作有抑制作用。其主要的作用機制可能是抑制了γ-氨基丁酸 (GABA)降解過程中GABA轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶活性，從而使腦內(nèi)GABA含量增高所致［2］。與丙戊酸鈉相比，雙丙戊酸鈉由于胃腸道副反應(yīng)更輕、毒性更小、藥物相互作用較少，已取代了傳統(tǒng)丙戊酸鈉的市場地位［3］。雙丙戊酸鈉腸溶片治療癲癇每日用量600 ～1 200 mg，服用2～3次，服藥頻率較高，導(dǎo)致患者依從性較差。目前國外已有雙丙戊酸鈉緩釋片上市，國內(nèi)還鮮有報道。

國內(nèi)制劑工藝優(yōu)化和處方篩選常用均勻設(shè)計和正交設(shè)計，但該兩種方法實驗精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性較差。采用固定其他因素改變某一因素的單因素考察法能收到一定效果，但條件優(yōu)選憑經(jīng)驗，且無法考察各因素間的相互作用［4］。Plackett-Burman試驗設(shè)計常用于考察多個因素對結(jié)果的影響，優(yōu)選主要影響因素;星點設(shè)計具有試驗次數(shù)少、精度高等特點，常結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)化考察因素。目前三者聯(lián)合應(yīng)用較成熟［5－9］，可以為制劑處方篩選提供依據(jù)。

本文用美國雅培公司 (Abbott)生產(chǎn)的雙丙戊酸鈉緩釋片 (商品名:Depakote?)為參比制劑，基于Plackett-Burman試驗優(yōu)選的主要影響因素，采用星點設(shè)計—效應(yīng)面法優(yōu)選雙丙戊酸鈉緩釋片處方，制成每天給藥一次的雙丙戊酸鈉緩釋片(每片250 mg)，避免普通制劑服用后，血藥濃度的波峰波谷現(xiàn)象，同時減少服藥次數(shù)，方便臨床用藥，為骨架緩釋片的處方篩選提供新思路。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 ZRS-8G智能溶出儀 (天津市天大天發(fā)科技有限公司);安捷倫8453紫外分光光度計 (安捷倫科技有限公司);島津LC-15C高效液相色譜儀、SPD-15C紫外檢測器及LCsolution Lite色譜工作站(島津制作所);ZDY-8重型單沖壓片機(上海遠東制藥機械總廠);Delta 320pH計 (Mettler-Toledo儀器有限公司);XS105分析天平(Mettler-Toledo儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 雙丙戊酸鈉原料藥 (合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，含量99.37%，批號20130601);雙丙戊酸鈉緩釋片 (美國雅培公司，批號:1015725);HPMC K100M、HPMC K15M(上?？房蛋录夹g(shù)有限公司);乳糖 (安徽山河藥用輔料股份有限公司);微晶纖維素 (安徽山河藥用輔料股份有限公司);PEG6000(天津天成制藥);鹽酸(上海振企化學(xué)試劑有限公司);氫氧化鈉 (天津星馬克科技有限公司);乙腈(百靈威科技有限公司，色譜純);甲醇(百靈威科技有限公司，色譜純)。

2 實驗方法

2.1 釋放度分析方法的建立 按照美國食品藥品監(jiān)督管理局 (Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)官方網(wǎng)站上公布的“固體制劑溶出曲線數(shù)據(jù)庫”關(guān)于原研制劑雙丙戊酸鈉緩釋片的溶出方法，同時依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評中心關(guān)于仿制藥體外溶出實驗相關(guān)指導(dǎo)原則，本次研究選擇FDA推薦的pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液作為本品釋放度測定的標準介質(zhì)，體積為900 mL，轉(zhuǎn)速為100 r·min－1。

2.1.1 檢測波長的選擇 取雙丙戊酸鈉對照品適量，用標準介質(zhì)溶解并定量稀釋成每1 mL中約含雙丙戊酸鈉10 μg的溶液，照紫外—可見分光光度法(中國藥典2010年版二部附錄IV A)，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。

2.1.2 標準曲線的建立 精密稱定雙丙戊酸鈉對照品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加標準介質(zhì)溶解至刻度，得濃度為1 g·L－1的貯備液。精密量取5 mL貯備液至100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，再分別精密量取上述溶液 1、2、3、5、10、25 mL 于100 mL容量瓶中，用標準介質(zhì)稀釋到刻度，以標準介質(zhì)為空白，照高效液相色譜法(中國藥典2010年版二部附錄V D)測定，以峰面積對濃度進行線性回歸。

2.1.3 精密度及中間精密度試驗 取雙丙戊酸鈉緩釋片劑細粉適量，精密稱定，加標準介質(zhì)稀釋成每1 mL約含雙丙戊酸鈉0.2 mg的溶液，重復(fù)進樣6次，考察方法的精密度，同時在此操作條件下，分別由不同實驗人員在不同天進行測定，考察方法的中間精密度。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取雙丙戊酸鈉片劑細粉適量，精密稱定，加入標準介質(zhì)溶解并稀釋成每1 mL含雙丙戊酸鈉0.2 mg的溶液，分別于0、2、4、6 和8 h測定，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。

2.1.5 回收率試驗 按處方量的80%、100%、120%分別精密稱取雙丙戊酸鈉對照品，按處方比例加入輔料混勻，置200 mL容量瓶中，加入標準介質(zhì)并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1 mL置50 mL容量瓶中，用標準介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，進高效液相色譜儀并計算回收率，記錄峰面積，計算回收率。

2.2 雙丙戊酸鈉緩釋片的制備 將雙丙戊酸鈉原料過100目篩與HPMC K100M、HPMC K15M、乳糖、PEG6000充分混合，以乙醇作為潤濕劑制軟材，20目篩制粒、烘干、20目篩整粒，混合均勻后壓片，片重約650 mg。

2.3 Plackett-Burman實驗設(shè)計篩選主要影響因素 Plackett-Burman試驗設(shè)計是一種兩水平的析因設(shè)計，可從較多因素中篩選出少數(shù)重要因素。每個因素取兩水平，通過比較兩水平之間的差異性來確定因子的顯著性，對于N次實驗至多可研究N－1個因子，但實際因子應(yīng)該不多于N－4個，保留3個以上虛擬變量用以估計試驗誤差。

因素及水平范圍:根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選用HPMC K100M和HPMC K15M作為緩釋片的骨架材料，微晶纖維素和乳糖作為填充劑，乙醇作為潤濕劑，PEG6000作為潤滑劑，選取7個實驗因素(A:HPMC K15M用量、B:HPMC K100M用量、C:微晶纖維素的用量、D:乳糖用量、E:乙醇濃度、F:干燥時間、G:硬度)和 4個空白因素 (H、I、J、K)，合計 12 次實驗［4］。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定每個因素高、低兩個水平。用Design-expert 8.0軟件設(shè)計實驗并進行數(shù)據(jù)處理。Plackett-Burman實驗設(shè)計因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計的因素與水平

2.4 星點設(shè)計—效應(yīng)面法優(yōu)化處方 雙丙戊酸鈉緩釋片的規(guī)格是每片250 mg，主藥占40%。Plackett-Burman試驗表明HPMC K100M和HPMC K15M的量和潤濕劑乙醇的濃度是影響片劑釋放的主要因素。

根據(jù) Plackett-Burman實驗設(shè)計結(jié)果，采用HPMC K100M 用量(X1，mg)、HPMC K15M 用量(X2，mg)和乙醇濃度(X3，%)作為考察因素，查詢FDA規(guī)定HPMC K100M和HPMC K15M作為口服緩釋片處方最高用量分別為320 mg和80.25 mg，作為骨架材料的常規(guī)用量為不低于片重的25%。故其范圍為:X1:162.5～320 mg;X2:0 ～80.25 mg;X3:10%～90%。為與原研制劑的片重保持一致，自研片重應(yīng)在合理范圍內(nèi)波動，不足部分用乳糖填充。根據(jù)星點設(shè)計的原理，各因素設(shè)置5水平，該設(shè)計是在兩水平析因設(shè)計的基礎(chǔ)上加上極值和中心點構(gòu)成的，其代碼分別為 0、±1、±α，α=(F)1/4，F(xiàn)=2k(k為因素數(shù))為析因設(shè)計部分試驗次數(shù)［4］。對于三因素的星點設(shè)計，以緩釋片的綜合評分L值和相似因子f2值作為考察指標，采用Design Expert 8.0安排實驗，并對結(jié)果進行分析。因素及水平表見表2，具體實驗方案見表5。

表2 星點設(shè)計的因素和水平

參照《中國藥典》2010版二部附錄XIX D緩釋、控釋和遲釋制劑指導(dǎo)原則的規(guī)定，采用累積釋放度綜合評分法，對不同處方3、9、12、18 h四點的釋放度進行評分，將評分結(jié)果進行加權(quán)相加后得出總分，各點的評分方法參照美國藥典(USP)標準，3、9、12、18 h 的釋放度以 15%、55%、65%、75%，各點權(quán)重均設(shè)為1，總分的計算公式為:

L=︱P3－15%︱+︱P9－55%︱+︱P15－61%︱+︱P18－75%︱，L值越小，因素的水平數(shù)越佳。

采用相似因子法［10］，是指實驗制劑與對照制劑的累積釋放度差的平方和最小。計算公式如下:

式中n為取樣點總數(shù)，Rt和Tt分別為參比、實驗制劑的在t時的平均釋放度。f2值越接近100，曲線的相似性越好，f2大于50(50～100)說明兩條曲線相似。

對于因變量L值要求越小越好，而對于f2值則要求越大越好?？紤]到當f2值最大時L值并不一定最小，選擇總評“歸一值”法 (overall desirability，OD)，即將每個指標標準化為0～1之間的數(shù)值，各指標“歸一值”求算幾何平均數(shù)，得總評“歸一值”。對于綜合評分法和相似因子法采用Hassan方法分別進行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求“歸一值”［11］。OD值越大，因素水平數(shù)越佳。

以HPMC K100M和HPMC K15M用量和乙醇濃度為自變量，總評“歸一值”為因變量，進行多元線性回歸和二次多項式回歸，并以擬合優(yōu)度(r)和置信度(P)作為模型判定標準。擬合方程為

多元線性模型:

二次多項式模型:

由擬合所得到的模型繪制因素X1、X2、X3對指標的效應(yīng)面圖和等高線圖。通過固定三個自變量中之一為中值，以總評“歸一值”為因變量相對于另外兩個自變量繪制效應(yīng)面三維圖，最后根據(jù)效應(yīng)面優(yōu)選處方［12］。

3 結(jié)果和討論

3.1 釋放度分析方法 雙丙戊酸鈉對照溶液均在210 nm附近有最大吸收，且輔料在此范圍內(nèi)無明顯吸收，對主藥測定無干擾。以吸光度A對濃度C進行線性回歸，得到回歸方程 A=2.17 ×10－2C －1.7×10－3，r=0.999 8 結(jié)果表明雙丙戊酸鈉在濃度 0.410～12.64 mg·L－1線性關(guān)系良好，精密度、中間精密度、溶液穩(wěn)定性均較好，回收率在96% ～104%范圍內(nèi)，說明本研究所采用的釋放度方法學(xué)準確度高。

3.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果 7個因素與4個空白因素合計12次實驗，按照Plackett-Burman設(shè)計表進行試驗設(shè)計，每個試驗號重復(fù)3次，計算f2值。Plackett-Burman實驗設(shè)計和響應(yīng)值見表3。運用Design-expert 8.0軟件對各因素進行顯著性分析，見表4。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計和響應(yīng)值

表4 Plackett-Burman試驗結(jié)果方差分析

結(jié)果顯示P＜0.05的因素為主要影響因素［6］。結(jié)論:對各因素的顯著性分析可以看出，各因素對響應(yīng)值影響的顯著性順序為B＞A＞E＞G＞C＞D＞F，顯著性因素為 B(HPMC K100M)、A(HPMC K15M)和E(乙醇濃度)。

3.3 星點設(shè)計－效應(yīng)面法

3.3.1 模型擬合 根據(jù)星點設(shè)計原理，確定因素水平見表2，實驗設(shè)計及研究結(jié)果，如L值、f2值和OD值，見表5。

表5 星點設(shè)計實驗結(jié)果

采用多元線性模型對各影響因素和指標進行回歸計算，其方程如下:

采用二次多項式對各影響因素和指標進行數(shù)學(xué)模型擬合，方程如下:

為了保證模型擬合良好，需要檢查回歸模型的顯著性、模型系數(shù)的顯著性和失擬項的顯著性［13］。方差分析結(jié)果見表6，通常情況下，F(xiàn)值越大，P值越小，對應(yīng)的模型系數(shù)就越顯著，F(xiàn)值的失擬項為2.34相對于純誤差不顯著，校正擬合度和預(yù)測擬合度相關(guān)性良好，信噪比為20.501＞4等均表明回歸方程可以很好的預(yù)測因素和效應(yīng)值的關(guān)系。由擬合模型的r值可以看出多元線性模型擬合較差，二次多項式模型擬合較好，對系數(shù)采用置信度P＞0.05為不顯著，剔除不顯著的模型系數(shù)，由表6可知剔除系數(shù)A、B。優(yōu)化后模型的r值沒有明顯減小，所以模型仍具有較高可信度，優(yōu)化后的方程為:

表6 二次模型響應(yīng)面的方差分析

3.3.2 效應(yīng)面優(yōu)化 選擇優(yōu)化后的方程為模型，應(yīng)用Design Expert 8.0軟件，以O(shè)D值為縱坐標，固定3個自變量中1個為中值，其他2個自變量為橫坐標，繪制三維效應(yīng)面 (response surface)圖［15］，如圖1～3。

由圖1可見，在一定范圍內(nèi)，隨著 HPMC K100M用量增大，OD值增大，HPMC K15M對OD值有先增大后減小的趨勢。圖2中乙醇濃度增大，OD值增大，HPMC K100M增大，OD值增大，增大到某一值后，HPMC K100M反而減小，這是因為隨著HPMC K100M用量增大所占片重比例增大，此時HPMC K15M和乙醇濃度已經(jīng)不能調(diào)節(jié)藥物的釋放，圖3中隨著K15M和乙醇濃度增大，OD值先增大后減小，但乙醇濃度對OD值的影響較HPMC K15M、HPMC K100M小，這也驗證了 Plackett-Burman試驗結(jié)果。

由效應(yīng)面優(yōu)化的基本原理選取較佳處方區(qū)域回推至因素的取值范圍［16］，由軟件自動優(yōu)化后得到最佳處方結(jié)果為 HPMC K100M 286.72 mg，HPMC K15M 16.96 mg，乙醇濃度 27%。

3.3.3 處方驗證 按優(yōu)化的處方制備3批雙丙戊酸鈉緩釋片，每批1 000片，按公式“偏差=(預(yù)測值－實際值)/預(yù)測值×100%”計算偏差，結(jié)果見表7，考察自研片三批與原研片在標準介質(zhì)中的累積釋放度，見圖4，說明所建模型具有很好的預(yù)測能力。

表7 預(yù)測值與實測值比較(n=3)

4 討論

利用Plackett-Burman設(shè)計用于固體制劑處方與工藝優(yōu)化的相關(guān)文獻報道較少。由于影響緩釋片釋放度的因素較多，如骨架材料的黏度和用量、填充劑的種類和用量、黏合劑的種類和用量、制備工藝、壓片的壓力等。本研究在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上采用了Plackett-Burman設(shè)計并運用相似因子f2值為指標篩選了影響雙丙戊酸鈉緩釋片的主要影響因素，并運用多因素五水平的星點設(shè)計進行非線性擬合，此種方法具有操作簡單、試驗次數(shù)少、精度高、預(yù)測性好等優(yōu)點［16］。實驗結(jié)果表明二次多項式回歸對實驗中各因素和指標進行擬合，優(yōu)化后相關(guān)系數(shù)(r)較佳，可以作為分析及預(yù)測的模型。同時通過效應(yīng)面優(yōu)化，從三維效應(yīng)面圖和二維等高線圖中可以得到較佳處方，按照較佳處方制備3批雙丙戊酸鈉緩釋片，各批的實測值與預(yù)測值的偏差均較小。

親水凝膠型骨架緩釋片研發(fā)的核心問題是骨架材料的種類以及用量的選擇。通過分別考察不同黏度的羥丙基甲基纖維素，發(fā)現(xiàn)采用單一的骨架材料難以滿足溶出實驗的需求，因此本實驗選取了HPMC K100M和HPMC K15M聯(lián)合作為骨架材料，其中HPMC K100M用于控制后半段藥物釋放速率，HPMC K15M用于提高前半段藥物釋放速率，使其能迅速達到治療窗口血藥濃度，兩者聯(lián)合可以有效的控制藥物的釋放［17－19］。

在實驗中發(fā)現(xiàn)潤濕劑乙醇濃度對藥物釋放行為影響較大，不同濃度乙醇對溶出度的影響主要是通過影響顆粒的比表面積來影響藥物的釋放行為，高濃度的乙醇制粒，由于乙醇的揮發(fā)速率較快，顆粒表面的致孔作用較為明顯，使顆粒的比表面積增大，從而促進藥物的釋放。

以往的實驗設(shè)計的考察都是以某個點或者某幾個點的釋放度作為指標，這不能反應(yīng)出藥物的體內(nèi)外相關(guān)性，也不能完全體現(xiàn)原研制劑和自研制劑在內(nèi)在品質(zhì)的差異，給接下來的生物等效性實驗埋下了隱患。目前通用的藥物溶出度評測指標為相似因子f2，它反應(yīng)的是自研與原研樣品溶出曲線在圖形上的相似性，為了更好的比較原研與自研的差別，反映出兩者在內(nèi)在品質(zhì)上的相似性，本實驗引入了L值作為第二個評價指標，L值反映的是每個點自研和原研相比的波動情況。由于相似因子f2值的最佳與L值最佳不一定完全吻合，因此本實驗選擇總評“歸一值”進行最終評價。

在骨架型緩釋片的研究中引入Plackett-Burman設(shè)計聯(lián)合星點設(shè)計－效應(yīng)面法進行實驗設(shè)計，可以大大的減少處方實驗的數(shù)量，同時對藥物的溶出特性有了科學(xué)而全面的認識，對于提高我國的仿制藥行業(yè)的水平有著重要意義。

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