房振宇，劉永梅，王全勝

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽巢湖 238000)

急性腎小管壞死(acute tubuLar necrosis，ATN)是一種臨床常見的疾病，是急性腎功能衰竭的重要原因，ATN發(fā)生的主要原因是腎臟局部的缺血損傷。骨髓干細(xì)胞是體內(nèi)重要的一類組織干細(xì)胞，研究表明骨髓干細(xì)胞能分化成腎小球細(xì)胞［1-2］。重癥不可逆ATN不能恢復(fù)的主要原因是由于損傷區(qū)域殘存小管細(xì)胞的自身修復(fù)能力差，如果從骨髓來(lái)源的細(xì)胞轉(zhuǎn)化增多，成為修復(fù)的主力，勢(shì)必改善重癥ATN的預(yù)后。然而，骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腎小管細(xì)胞的數(shù)量有限，轉(zhuǎn)化效率也不甚理想。

研究發(fā)現(xiàn)一些中藥對(duì)骨髓干細(xì)胞可能有重要的影響［3-4］，川芎嗪促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的增生，使得進(jìn)入血循環(huán)中的骨髓干細(xì)胞增多，理論上發(fā)生轉(zhuǎn)化的骨髓干細(xì)胞也增多，而這正有利于ATN腎小管上皮細(xì)胞的恢復(fù)?；谝陨系难芯炕A(chǔ)，我們推測(cè)川芎作為干細(xì)胞分化，增殖的調(diào)控手段，對(duì)于骨髓干細(xì)胞在受體腎臟的分化將會(huì)起到積極的作用，可加速病變腎小管的修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 材料和制劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～6周齡(體重18～22 g)綠色熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因雄性C57BL/6小鼠35只為骨髓供體(美國(guó)匹茲堡大學(xué)腫瘤研究中心程濤教授惠贈(zèng))，6～8周齡(體重18～22 g)清潔級(jí)C57BL/6小鼠60只(購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.1.2 試劑 兔抗GFP多抗(Abcam公司)生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗試劑盒(Labvision公司)20%川芎嗪(上海第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院自制)GM-CSF(特爾立)廈門特寶生物工程有限公司(批號(hào):20031027)。

1.1.3 分組 60只清潔級(jí)雌性C57BL/6小鼠，施行骨髓移植及缺血再灌注手術(shù)后隨機(jī)分成3組。(1)骨髓移植+甘油注射組:給予60Co照射后進(jìn)行骨髓移植，于移植后8周進(jìn)行甘油注射，于注射后持續(xù)1周使用0.9%生理鹽水注射，20只。(2)骨髓移植+甘油注射+20%川芎嗪組:給予60Co照射后進(jìn)行骨髓移植，于移植后8周進(jìn)行甘油注射，于注射后持續(xù)1周使用20%川芎嗪干預(yù)，20只。(3)骨髓移植+甘油注射+GM-CSF組:給予60Co照射后進(jìn)行骨髓移植，于移植后8周進(jìn)行甘油注射，于注射后持續(xù)1周使用GM-CSF干預(yù)，20只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.2.1 骨髓有核細(xì)胞的提取 用酒精(75%)將GFP標(biāo)記使用脫臼方法處死的C57BL/6小鼠浸泡約5～10 min。隨后在無(wú)菌條件下分離出小鼠的脛骨和股骨，分別剪去兩端的骨皮質(zhì)。將小鼠的脛骨和股骨用7號(hào)針頭以LG-DMEM(低糖型 DMEM(GIBCOBRL公司產(chǎn)品)約1 mL沖出骨髓后，將沖出的骨髓液依次經(jīng)過(guò)7號(hào)和4號(hào)針頭吹打，再經(jīng)過(guò)鋼篩過(guò)濾成單細(xì)胞懸液。此單細(xì)胞懸液使用紅細(xì)胞裂解液在4°C下裂解10 min，再使用PBS(0.01 mmol·L-1pH7.4磷酸鹽緩沖液)洗滌成骨髓有核細(xì)胞。得到的骨髓有核細(xì)胞再次使用含10%FBS(胎牛血清)的LG-DMEM重懸成單細(xì)胞懸液。最后檢查骨髓有核細(xì)胞活力(要求細(xì)胞活力在95%以上)。

1.2.2 骨髓移植 在移植前5 d用含紅霉素(250 mg·L-1)的抗生素溶液給受體鼠服用進(jìn)行腸道準(zhǔn)備。移植時(shí)使用特制的表面多孔的塑料盒，將小鼠置入其中，讓其全身均勻接受60Co照射(總劑量7.5 Gy)，照射后6 h內(nèi)，將供體小鼠骨髓有核細(xì)胞以1 mL注射器25號(hào)針頭經(jīng)尾靜脈按每只每0.2mL含有2×106個(gè)細(xì)胞注射。此后將受體小鼠移入超凈臺(tái)(附帶空氣過(guò)濾帽的塑料透明鼠盒)，使用60Co照射消毒后的食物，高壓消毒的飲水(測(cè)定pH 3～5)喂養(yǎng)，并飲用含紅霉素的抗生素溶液2周。

1.2.3 肌肉注射甘油誘導(dǎo)ATN模型 在接受注射前18 h到注射后8 h內(nèi)不給予實(shí)驗(yàn)小鼠飲水，增加甘油毒性。將甘油(純度＞98%)用雙蒸水稀釋至50%，按預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的最佳劑量7.5 mL·kg-1，于小鼠雙側(cè)后肢肌肉各予以1/2劑量注射。

川芎嗪及GM-CSF的具體使用方法如下:(1)1組0.9%生理鹽水0.2 mL每天;(2)2組20%川芎嗪2 mg·kg-1每天;(3)3組 GM-CSF 10μg·kg-1每天。

1.3 標(biāo)本處理及觀察

1.3.1 血常規(guī)，肌酐，尿素氮檢測(cè) 以2% 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，心臟穿刺取血，將20μL小鼠血液置于EDTA抗凝的Ependoff管中，血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血液常規(guī)。1 mL血液，靜置30 min，3 000 r·min-1離心30 min后收集血清，Beck自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清尿素氮，血清肌酐。

1.3.2 病理切片 脫臼處死小鼠，取腎臟組織，在10% 中性福爾馬林浸泡固定，常規(guī)脫水、浸蠟并包埋。常規(guī)制備石蠟?zāi)I組織切片。HE染色。光鏡下觀察病變，同時(shí)采用Vyacheslav等的半定量方法評(píng)估腎小管損傷程度。腎小管損傷定義為:腎小管壞死或刷狀緣脫落、管型形成、管腔擴(kuò)張，每張切片至少計(jì)數(shù)10個(gè)視野(200倍)。按受損小管比例評(píng)分:0.無(wú)病變;1.≤10%;2.11% ～25%;3.26% ～45%;4.46% ～75%;5.＞76%。

1.3.3 冰凍切片 以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開胸，心臟穿刺取血，先用100 mL 0.01 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.3)經(jīng)心臟沖洗血液，再用500 mL含4%多聚甲醛0.1 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.3)灌注固定。灌畢立即取雙側(cè)腎臟標(biāo)本并置于上述相同的固定液中后固定4 h(4°C)，然后移入含25%蔗糖的0.1 mmol·L-1的PB中，4℃過(guò)夜。冷凍連續(xù)切片，片厚5μm。切片分2套，分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡觀察。

1.3.4 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)GFP表達(dá) 石蠟?zāi)I組織切片(4μm)58℃烘干，18 h，常規(guī)脫蠟至水，使用3%H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，將切片置于預(yù)加熱到 98℃，pH6.0，0.01 mol·L-1檸檬酸緩沖液中，微波Ⅲ檔(98℃)，20 min，自然冷卻到室溫進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗3 min×3，加GFP一抗(鼠)1∶500 4℃過(guò)夜，PBS洗 3×3 min。b-SAR IgG 1∶200，37℃，30 min。PBS 洗 3 min ×3，S-HRP 1∶400，37℃，30 min，PBS 洗3 min ×3。0.4%DAB+0.03%H2O2顯色 12 min，水洗，蘇木精襯染，常規(guī)樹酯封片。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡12只，2只因麻醉死亡，4只因取血死亡，6只因注射甘油及骨髓移植死亡。

剩余動(dòng)物1組15只，2組15只，3組18只。

2.2 血肌酐尿素氮 使用生理鹽水、川芎嗪、GMCSF在注射后7 d血肌酐、尿素氮有一過(guò)性升高，28 d血肌酐尿素氮無(wú)明顯變化。見表1。

表1 尿素氮、肌酐在3組中的變化

2.3 血常規(guī) 1、2組在手術(shù)后7、28 d內(nèi)白細(xì)胞、紅細(xì)胞均未見明顯變化。3、4組在術(shù)后7 d白細(xì)胞、紅細(xì)胞增加，28 d恢復(fù)1、2組水平。見表2。

表2 白細(xì)胞、紅細(xì)胞在3組中的變化

2.4 流式細(xì)胞儀法 骨髓移植后5 d甘油注射后14 d，流式細(xì)胞儀法測(cè)骨髓中 GFP(+)細(xì)胞數(shù)目，見表3。2、3組其 GFP(+)骨髓細(xì)胞數(shù)占的比率較1組有升高。

表3 GFP陽(yáng)性細(xì)胞在骨髓細(xì)胞中的比率/%

2.5 病理切片 骨髓移植行后甘油注射后予以生理鹽水(A)，川芎嗪(B)，GM-CSF(C)，第 14、28 天的腎臟缺血側(cè)(L)的HE染色(圖1)HSK評(píng)分:第14天時(shí)腎臟A組與B組損傷差異明顯，C組顯示壞死較A組好轉(zhuǎn)，但炎細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增多。B組的變化較其余各組更明顯，基本無(wú)損傷表現(xiàn)，其它各組損傷也恢復(fù)(表4)。

表4 各組的HSK積分

2.6 熒光顯微鏡 骨髓移植后進(jìn)行甘油注射，之后予以生理鹽水(A)，川芎嗪(B)，GM-CSF(C)。干涉第14天，GFP熒光在各組的顯示，透視象表現(xiàn)及疊加象表現(xiàn)(圖2)。

2.7 免疫組化 骨髓移植后行甘油注射，之后予以生理鹽水(A)，川芎嗪(B)，GM-CSF(C)第14天，28天GFP陽(yáng)性細(xì)胞的分布(圖3)，計(jì)數(shù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞占腎小管上皮細(xì)胞的比率(表5)。

3 討論

近年來(lái)隨著對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究的逐漸深入，其參與體內(nèi)許多器官的修復(fù)的特性正在被越來(lái)越關(guān)注［5］。但這種研究與臨床的需求還有很大的差距，其參與修復(fù)的數(shù)量及效果也遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到臨床所需求的標(biāo)準(zhǔn)，因此對(duì)于是否能通過(guò)促進(jìn)骨髓增殖的手段達(dá)到提高骨髓干細(xì)胞參與受損器官修復(fù)的數(shù)量，正日益受到廣泛的關(guān)注［6］，兩項(xiàng)國(guó)內(nèi)的研究也曾使用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor)及粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員骨髓干細(xì)胞促進(jìn)修復(fù)大鼠的急性腎損傷［7-8］。

我們的研究結(jié)果表明，甘油注射引起的急性腎小管壞死后，腎功能的變化是一過(guò)性的，川芎嗪或GM-CSF的使用，也并無(wú)明顯對(duì)腎功能變化的影響。單純使用川芎嗪的促骨髓細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)化為外周血細(xì)胞的效果并不是很明顯，GM-CSF對(duì)于外周血象的影響是一個(gè)短暫的骨髓動(dòng)員的過(guò)程。流式細(xì)胞儀的結(jié)果可以看出川芎嗪及GM-CSF對(duì)于供體骨髓細(xì)胞的增殖是由促進(jìn)作用的，即使用后供體骨髓細(xì)胞所占總骨髓細(xì)胞的比率較對(duì)照組上升。病理切片以及組織學(xué)評(píng)分:首先，川芎嗪對(duì)于腎小管損傷腎臟的修復(fù)有一定的促進(jìn)作用，可以看到壞死范圍縮小，細(xì)胞數(shù)目增多，修復(fù)的程度，速度均較對(duì)照組有升高。而使用GM-CSF的組能看到壞死范圍縮小，細(xì)胞數(shù)目的增多。但同時(shí)炎細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目也較對(duì)照組有增多，因此我們覺(jué)得川芎嗪對(duì)于急性腎小管壞死的修復(fù)有促進(jìn)作用，其促進(jìn)作用的發(fā)揮可能也與川芎本身改善腎臟微循環(huán)，修復(fù)腎損傷的作用有關(guān)，而GM-CSF對(duì)于急性腎小管壞死的修復(fù)造成的影響，目前看來(lái)是有利有弊的，具體發(fā)生機(jī)制還需要進(jìn)一步分析。熒光顯微鏡為我們提供了一些川芎嗪和GM-CSF在骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腎小管上皮細(xì)胞中所起到的作用的一些初步的證據(jù)，根據(jù)大體的觀察，我們能夠看到，川芎嗪組和GMCSF組綠色熒光較對(duì)照組增多。而使用免疫熒光做進(jìn)一步計(jì)算機(jī)圖形計(jì)數(shù)，通過(guò)免疫熒光的照片，能發(fā)現(xiàn)川芎嗪和GM-CSF組較對(duì)照組的外源性腎小管上皮細(xì)胞均有一定的升高。

近年來(lái)有研究通過(guò)改變骨髓移植的時(shí)間點(diǎn)來(lái)觀察骨髓干細(xì)胞對(duì)腎小管損傷修復(fù)的影響，認(rèn)為早期移植效果較好，急性腎損傷發(fā)生4～8周時(shí)效果最佳［8-9］，我們的實(shí)驗(yàn)則通過(guò)一些促骨髓增殖的因素，增加循環(huán)中骨髓干細(xì)胞的數(shù)目，最終也觀察骨髓干細(xì)胞向腎小管分化的量的增多。首先證實(shí)了骨髓干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為腎小管上皮細(xì)胞，進(jìn)一步支持了以前各類相關(guān)研究得出的結(jié)論，其次反映了中藥川芎嗪通過(guò)對(duì)骨髓的增殖作用，促進(jìn)了骨髓干細(xì)胞對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。但有研究曾得出結(jié)論認(rèn)為大部分分化到修復(fù)受損的小管細(xì)胞來(lái)自于內(nèi)源性的細(xì)胞群，而不是骨髓衍生的細(xì)胞。還有研究認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要通過(guò)旁分泌的機(jī)制修復(fù)了腎小管損傷［10］。體外研究也顯示骨髓干細(xì)胞可以修復(fù)腎小管損傷但不能預(yù)防急性腎損傷的發(fā)生［11］，因此是否我們這里得出的外源性腎小管細(xì)胞還存在其他的來(lái)源和形式，修復(fù)這些受損的腎小管時(shí)，川芎嗪和GM-CSF這些促骨髓增殖因素是否有通過(guò)其他細(xì)胞因子或者旁分泌模式達(dá)到總體修復(fù)腎小管急性損傷，增加外源性有功能的腎小管上皮細(xì)胞可能是我們需要繼續(xù)探討的目標(biāo)。同時(shí)此類研究也探討了對(duì)使用骨髓干細(xì)胞減少慢性腎損傷腎間質(zhì)纖維化的可能［12］，當(dāng)然川芎嗪及 GMCSF是否也能促進(jìn)這些作用也需要繼續(xù)研究。

總之，通過(guò)我們的研究，我們可以證實(shí)川芎嗪和CM-CSF均可一定程度的增加骨髓干細(xì)胞對(duì)于腎小管急性損傷的修復(fù)作用。至于其修復(fù)機(jī)制是否存在其他因素影響以及其他作用大小仍需繼續(xù)研究。

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