李 清，周 暢

(1.江蘇省蘇州市相城人民醫(yī)院婦產科;2.江蘇省蘇州市立醫(yī)院婦產科，江蘇蘇州 215130)

子宮內膜異位癥(EMs)為臨床婦科常見的良性疾病，然而其病變部位廣泛，通常累及盆腔以及卵巢等部位，導致盆腔發(fā)生黏連，性交疼痛以及痛經不孕等癥狀［1－3］，并可能發(fā)生浸潤，轉移和復發(fā)等情況，嚴重損害患者的身體健康和生活質量。此疾病的發(fā)病機制還未闡明，近年來的深入研究，認為血管內皮生長因子能夠促進血管生成，血管調控重要機制包括Notch通路中的配體 Delta-like ligand4［4］;本次研究通過免疫組化SP聯合對45例EMs的異位子宮內膜，42例在位的內膜以及33例正常內膜中血管內皮生長因子(VEGF)以及細胞跨膜Notch配體4蛋白(DLL4)的表達水平進行檢測，對二者相關性進行分析，研究兩種蛋白在EMs發(fā)展中的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例組 本著隨機原則選取我院在2010年4月—2013年1月由于卵巢囊腫并進行腹腔鏡手術并且通過病理診斷為子宮內膜異位癥患者共45例，選擇其中子宮內膜發(fā)生異位(A組)，宮腔內膜在位(B組)42例(由于3未婚無性生活所以未取)。按照1987年美國生育協(xié)會修訂標準對患者進行分級:A組Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期25例;B組Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期23例。

1.1.2 對照組 選取同期由于不孕并進行宮腔鏡檢查的33例患者(C組)，將其宮頸的正常內膜組織取出。

1.1.3 納入標準 A、B、C三組患者處于月經周期中的子宮內膜生長期，患者年齡之間比較差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，因此具有可比性。在研究前患者均知情和同意，并且無其他內外科疾病，有規(guī)律的月經周期28～34 d，無子宮腺肌癥，排除其他類型婦科疾病和內分泌疾病以及生殖道炎癥，6個月期間無激素治療。

1.2 研究試劑 北京博奧森生物工程公司以及美國SANTA CRUZ公司生產的兔抗人DLL4，VEGF多克隆抗體(濃度為1∶100)，由北京中杉生物工程公司生產的DAB試劑顯色盒以及SP9000試劑盒。

1.3 研究方法 通過使用SP法對DLL4和VEGF蛋白進行檢測，使用0.9%濃度的NaCl注射液對標本中的血液等雜質進行沖洗，使用10%的甲醛進行固定，隨后脫水，石蠟包埋，以4μm標準進行切片，在60℃的烤箱中烘烤2 h，隨后進行脫蠟，水化，修復抗原，阻斷內源性過氧化酶，顯色，酒精梯度脫水，使用二甲苯透明并用中性樹膠封片。所有過程嚴格按照說明進行。PBS代替一抗試劑作為陰性對照，采用已知的陽性切片作為陽性對照。

1.4 結果判定 在顯微鏡下對切片進行觀察，DLL4與VEGF的陽性表達均以細胞質中出現棕黃色以及黃色顆粒標準。使用電腦圖像分析系統(tǒng)，選取符合隨機原則，選出5個陽性非重疊的高倍視野(×400)，并測定積分光密度(IOD)。

1.5 統(tǒng)計學方法 本次研究的數據處理采用SPSS16.0軟件。用(±s)表示計量資料，數據均符合正態(tài)分布，有方差齊性。多組間比較使用單因素方差分析，多重比較則使用LSD-t檢驗。此外，使用t檢驗進行A、B組的不同時期的比較，使用Pearson進行數據的相關性分析。顯著性水準α =0.05。

2 結果

DLL4以及VEGF都在子宮內膜腺體的上皮細胞胞質表達，間質細胞中胞質表達極少，因此不計入 IOD的分析計算。

2.1 VEGF和DLL4表達水平比較 行方差分析發(fā)現，各組患者DLL4和VEGF水平差異均有統(tǒng)計學意義，其中以A組最高，B組其次，C組最低，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表 1。

表1 VEGF和DLL4表達水平比較(±s)

表1 VEGF和DLL4表達水平比較(±s)

注:與 C 組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，▲P ＜0.05。

組別 例數 DLL4/μg·L－1 VEGF/ng·L －1 A 組 45 143.72±11.39▲＊ 149.36±9.13▲＊B 組 42 112.81 ±10.64* 121.61 ±6.28*C 組 33 91.42 ±8.47▲ 104.39 ±6.23▲F 238.743 267.921 P 0.000 0.000

2.2 VEGF和DLL4相關性 對三組患者DLL4和VEGF水平行相關性分析，發(fā)現A組和B組患者的2種蛋白的表達具有顯著一致性(P＜0.05)，而 C組無明顯相關性。見表2。

表2 VEGF和DLL4表達水平相關性分析(±s)

表2 VEGF和DLL4表達水平相關性分析(±s)

組別 例數 DLL4/μg·L－1 VEGF/ng·L－1r P A組45 143.72 ±11.39 149.36 ±9.13 0.854 0.000 B 組 42 112.81 ±10.64 121.61 ±6.28 0.729 0.000 C組33 91.42 ±8.47 104.39 ±6.23 0.142 0.346

2.3 A、B兩組不同分期的兩種蛋白表達比較 在A組中兩種蛋白Ⅰ～Ⅱ期的水平顯著低于Ⅲ～Ⅳ期(tDLL4=－7.374，P=0.000，tVEGF=－4.773，P=0.000)，B 組中的兩種蛋白Ⅰ～Ⅱ期的水平顯著低于Ⅲ～Ⅳ期(tDLL4=－5.557，P=0.000，tVEGF=－4.273，P=0.000)。見表 3。

表3 不同分期時VEGF和DLL4表達水平比較(±s)

表3 不同分期時VEGF和DLL4表達水平比較(±s)

注:組內與Ⅲ～Ⅳ期比較，*P＜0.05。

組別 例數 DLL4/μg·L－1 VEGF/ng·L －1 A 組 Ⅰ ～ Ⅱ期 20 135.62±5.69* 144.91±5.16*Ⅲ ～ Ⅳ期 25 152.30 ±7.95 153.27 ±8.63 B 組 Ⅰ ～ Ⅱ期 19 106.68±7.48* 119.20±4.51*Ⅲ ～ Ⅳ期23 122.37 ±8.39 126.33 ±5.24

3 討論

異位內膜細胞在宮外生長的主要原因為新生的血管所提供的血液供應，EMs在近年來其血管新生作用和機制受到廣泛關注;近年來發(fā)現DLL4是新型哺乳動物中的Notch信號途徑主要配體。根據相關研究表明，DLL4對血管內皮頂端細胞形成能夠起到抑制的作用，并且可以對細胞的密度，行為方式和位置進行調整。從而對血管內皮細胞分化以及血管網形成起到促進的作用。史淑紅等［5］根據RNA體外的干擾術對DLL4的表達進行下調，觀察到血管內皮細胞其遷移，增生和血管網的形成顯著被抑制;結果顯示DLL4是引導血管內皮細胞進行成熟分化重要因素;過去DLL4被認為在血管內皮細胞中特異表達，根據研究發(fā)現胰腺癌和肺癌等癌癥中DLL4表達水平均較高，并且與分期以及淋巴結轉移有關［6－7］;然而其在EMs很少被人關注和報道，通過本次研究，在異位內膜和在位的內膜的腺體上皮細胞中表達呈現陽性，且表達量顯著大于對照組(P＜0.05)，并且在異位內膜的表達水平顯著大于在位內膜(P＜0.05)，隨著異位內膜和在位內膜分期的增高其水平逐漸升高(P＜0.05)。表明其與EMs的發(fā)展有著很緊密的聯系。

VEGF是一種功能最強的促血管形成因子，本次研究表明:在異位內膜表達水平明顯高于在位內膜，在位內膜的表達水平明顯高于對照組，比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同葉青［8］之前的報道結果相同。表明VEGF表達高水平同EMs中的血管發(fā)生之間關系緊密。且其水平表達隨著病情分期的發(fā)展而逐漸升高(P＜0.05)。因此表明VEGF在EMs的發(fā)展中有著重要作用。

此次研究的過程中觀察到VEGF和DLL4可共同參與EMs的發(fā)生以及發(fā)展過程。根據研究說明，VEGF促進DLL4的表達，DLL4為VEGF的下游通路的負性調控因子，對血管的出芽以及形成分支起到了反饋性抑制，增加了血管的灌注并且減少了血管的密度。由此對EMs的發(fā)展過程進行推測，兩種蛋白互相反饋，可達到相對平衡的狀態(tài)，對新生血管的形成以及分化起到了促進作用。保證病灶的血液供應，對疾病的發(fā)展起到促進的作用。

研究表明:對DLL4進行抑制能夠對無功能的血管生成起到促進作用［9］，文獻報道運用DLL4特異性抗體對腫瘤進行處理，觀察到腫瘤內的DLL4-Notch通路的阻斷能夠產生許多無功能的新生血管，從而抑制腫瘤的發(fā)展［10］。主要抑制腫瘤新生血管的形成，對之前生成的血管無明顯影響。據此推斷:在臨床治療EMs的新靶點可能轉變?yōu)镈LL4-Notch，并且表明EMs靶向治療中DLL4抑制劑有良好的前景，并且其可靠性待進一步考證和研究。

［1］鄭婷婷，劉 義，于 嵐，等.靶向 siRNA阻斷 Wnt/β-catenin信號通路對子宮內膜異位癥裸鼠模型異位子宮內膜VEGF和MMP-9表達的影響［J］.華中科技大學學報(醫(yī)學版)，2011，40(1):22－27.

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［4］李曉平，張清富，陸 斌，等.DLL4，VEGF在肺腺癌中的表達及其與腫瘤血管生成的關系［J］.中國肺癌雜志，2009，9(8):2035－2036.

［5］史淑紅，李艷芳，高秀娟，等.子宮內膜異位癥患者異位、在位子宮內膜組織中VEGF、sflt-1 mRNA表達變化［J］.山東醫(yī)藥，2014，54(34):18－20.

［6］張安華，孫華文，蘇錦松，等.Notch1/DLL4信號通路與 VEGF在胃癌浸潤和轉移中的作用及其相關性［J］.中國普通外科雜志，2010，19(4):374－378.

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［8］葉 青.DLL4，HIF-1和 VEGF蛋白在子宮內膜異位癥患者異位內膜及在位內膜中的表達及意義［D］.鄭州:鄭州大學，2013.

［9］劉運鐸，孟凡玲，徐 冶，等.臨床病理相關性的研究［J］.實用腫瘤學雜志，2013，27(3):223－228.

［10］楊 瑞，張國新.DLL4蛋白在子宮內膜異位癥組織中的表達及意義［J］.中國生化藥物雜志，2014，12(7):96－98.