亓俊華 聶 剛 吳 梅 劉曉萍 陳民佳 朱 明 袁培松 張 婭 宋昱慶 郭 韡 邢 偉 李向云 羅東林 黃 宏 徐 祥

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,第一研究室，重慶 400042；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，山東 青島 266071；3溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，浙江 溫州 325000；4. 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，人體顯微結(jié)構(gòu)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

論 著

Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)低濃度過(guò)氧化氫對(duì)小鼠表皮干細(xì)胞的促增殖作用

亓俊華1,2聶 剛3吳 梅4劉曉萍2陳民佳1朱 明1袁培松1張 婭1宋昱慶1郭 韡1邢 偉1李向云1羅東林1黃 宏1徐 祥1

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,第一研究室，重慶 400042；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，山東 青島 266071；3溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，浙江 溫州 325000；4. 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，人體顯微結(jié)構(gòu)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

目的：探討低濃度過(guò)氧化氫（H2O2）對(duì)小鼠表皮干細(xì)胞（mESCs）體外促增殖作用及其機(jī)制。方法：以酶消化法分離培養(yǎng)mESCs。免疫熒光技術(shù)鑒定第3代mESCs β1整合素和角蛋白19（K19）表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD34的表達(dá)；以不同低濃度H2O2（0、25、50、100、150 和200 μmol/L）處理mESCs 48 h和72h。同時(shí)，另一組實(shí)驗(yàn)中在用不同濃度H2O2刺激的同時(shí)加入或不加入雷帕霉素（50 ng/ml）培養(yǎng)48 h。甲氮甲唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖； Western Blot 法檢測(cè)H2O2刺激小鼠mESCs 48 h Akt/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白mTOR、Akt、P70s6k、eIF4E、4E-BP1、p-mTOR、p-Akt、p-P70s6k、p-eIF4E、p-4E-BP1和細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)。結(jié)果：免疫熒光技術(shù)檢測(cè)分離培養(yǎng)的mESCs細(xì)胞100%表達(dá) β1整合素和K19；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)99.8%的mESCs表達(dá)CD34；MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，48 h和72 h時(shí)25 μmol/L和50 μmol/ L的H2O2可以有效地促進(jìn)mESCs的增殖（P＜0.05），而雷帕霉素能拮抗這一效應(yīng)；但當(dāng)H2O2濃度為200 μmol/L時(shí)，則顯著抑制mESCs增殖 (P＜0.05)；免疫印跡結(jié)果顯示低濃度H2O2處理mESCs 48 h后，Akt/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白mTOR、Akt、eIF4E、4E-BP1水平及其磷酸化水平（p-mTOR、p-eIF4E、p-4E-BP1）顯著增加 (P＜0.05或P＜0.01)，當(dāng)H2O2濃度為200 μmol/L時(shí)則抑制其表達(dá) (P＜0.05或P＜0.01)。此外，50 μmol/L的H2O2能上調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和PCNA的表達(dá)，而雷帕霉素能拮抗這一作用。結(jié)論：低濃度的H2O2對(duì)mESCs有明顯的促增殖作用，并且能激活A(yù)kt/mTOR通路。而低濃度H2O2對(duì)mESCs的促增殖作用至少部分是通過(guò)活化Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的。

表皮干細(xì)胞 過(guò)氧化氫 Akt/mTOR信號(hào)通路 細(xì)胞增殖

過(guò)氧化氫（H2O2）是一種強(qiáng)氧化劑，是外科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的消毒劑，具有殺菌、防腐、清潔創(chuàng)面的作用。然而臨床醫(yī)生驚奇地發(fā)現(xiàn)應(yīng)用H2O2處理后的創(chuàng)面，不僅潔凈、無(wú)感染，而且創(chuàng)面肉芽生長(zhǎng)良好、創(chuàng)面關(guān)閉顯著提前，顯示出明顯的促愈效應(yīng)[1-2]。據(jù)報(bào)道,低濃度H2O2對(duì)創(chuàng)面有促愈效應(yīng)，其機(jī)制主要是促進(jìn)創(chuàng)面血管新生，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖[1-3]。但低濃度H2O2對(duì)創(chuàng)面修復(fù)主要的始動(dòng)細(xì)胞－表皮干細(xì)胞（mESCs）的作用尚不清楚。mESCs作為皮膚組織的特異性干細(xì)胞，是皮膚組織(含皮膚附件) 發(fā)生、創(chuàng)面修復(fù)及改建的關(guān)鍵細(xì)胞[4]。mESCs主要分布于表皮基底層和毛囊隆突部，皮膚損傷后，它們是促進(jìn)再上皮化的主要修復(fù)細(xì)胞。因此，探討mESCs的增殖分化以及調(diào)控機(jī)制對(duì)于臨床修復(fù)皮膚損傷、治療皮膚疾病、構(gòu)建組織工程皮膚的意義十分重大。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalia target of rapamycin，mTOR）是一種存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的Ser/Thr激酶，研究證明mTOR是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、遷移和血管生成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要調(diào)控蛋白，相應(yīng)的Akt/mTOR信號(hào)通路是維持皮膚內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和再生的重要信號(hào)通路[5-6]。研究證實(shí)，mTOR可以被活性氧活化[3]，根據(jù)氧化應(yīng)激程度，它會(huì)造成細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)停止、衰老、凋亡（程序性細(xì)胞死亡）或壞死[7]。為此，我們通過(guò)體外分離培養(yǎng)mESCs，觀察低濃度的H2O2對(duì)mESCs生長(zhǎng)、增殖的影響，同時(shí)觀察對(duì)細(xì)胞存活、增殖相關(guān)的Akt/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Akt、mTOR、P70s6k 和eIF4E表達(dá)的作用，為低濃度的H2O2應(yīng)用于臨床創(chuàng)面治療，尤其是難愈創(chuàng)面治療提供充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 EMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基（Hyclone公司），PBS粉劑（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS）、I型膠原酶、D-Hanks、胰酶、EDTA（Gibco公司），BSA、Hochest33342（Sigma公司）、β1整合素抗體（武漢博士德公司），鼠抗兔IgG（北京中山公司），角蛋白19(K19)抗體（博奧森公司），磷酸化mTOR (p-mTOR)、磷酸化Akt (p-Akt)、磷酸化P70s6k (p-P70s6k)、磷酸化eIF4E (p-eIF4E)、eIF4E、mTOR、Akt、P70s6k、β-actin抗體（Cell Signaling公司），Cyclin D1和PCNA（Santa公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠mESCs的分離提取 新生昆明小鼠，清潔級(jí)，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。無(wú)菌獲取新生昆明小鼠背部皮膚，浸泡在無(wú)菌PBS溶液中充分清洗，用眼科剪和眼科鑷盡量去除皮膚上附著的脂肪，將皮膚剪成1 mm ×1 mm大小的小塊，置于0.02%的I型膠原酶中4 ℃過(guò)夜，次日用眼科鑷小心分開(kāi)表皮和真皮，表皮用含有0.02%EDTA和0.25%胰酶的消化液37 ℃消化30 min，過(guò)400目細(xì)胞篩，置于含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.2 免疫熒光技術(shù)鑒定小鼠mESCs 取第3代mESCs接種于載玻片上，4%多聚甲醛室溫固定，5%BSA 37 ℃封閉30 min；滴加1%BSA稀釋的β1整合素和角蛋白19（K19）抗體（1:100）， 4 ℃孵育過(guò)夜；加異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育2 h，Hochest33342染核，50%三磷酸甘油封片。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠mESCs CD34的表達(dá) 取融合率達(dá)到80%的第3代mESCs，用不含EDTA的0.25%胰酶消化、離心、計(jì)數(shù)，取1×105～1×108個(gè)細(xì)胞，分兩管，用無(wú)菌PBS洗兩次，用100 μl PBS稀釋的CD34-FITC抗體及其同型對(duì)照抗體室溫孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 甲氮甲唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)低濃度的H2O2對(duì)mESCs增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔3×103個(gè)細(xì)胞（100 μl）的數(shù)量接種在96孔板。實(shí)驗(yàn)①：以不同終濃度H2O2（0、25、50、100、150和200 μmol/L）刺激mESCs，在37 ℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)48 h、72 h。實(shí)驗(yàn)②：用不同濃度H2O2（0、25、50、100、150和200 μmol/L）刺激mESCs的同時(shí)加入或不加入雷帕霉素50 ng/ ml，培養(yǎng)48 h。細(xì)胞在處理完畢之后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl充分溶解，待甲臜完全溶解后，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處讀取吸光度（A490）值。

1.2.5 免疫印記技術(shù)（Western Blot）檢測(cè)低濃度H2O2對(duì)細(xì)胞Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 mESCs經(jīng)不同濃度H2O2刺激48 h后，提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。各組取50 μg等量總蛋白上樣，經(jīng)8%、10%、15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離后，半干轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，8 V轉(zhuǎn)膜90 min。5%脫脂牛奶－PBS封閉2 h；分別加入以下一抗： mTOR、Akt、 P70s6k、eIF4E、4E-BP1、p-Akt(308)、p-mTOR、p-P70s6k、p-4E-BP1、p-eIF4E (均為1:500稀釋)或β-actin (1:5 000稀釋)，4 ℃搖床上孵育過(guò)夜。次日洗膜，加入二抗（羊抗兔，1:10 000稀釋），室溫孵育2～3 h。洗膜后，采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法顯色，顯影于X光片上。采用LabWorks4.6軟件對(duì)目的蛋白和β-actin條帶行灰度值分析，以兩者比值代表目的蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)雷帕霉素對(duì)低濃度H2O2誘導(dǎo)的干細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響 0和50 μmol/L的 H2O2刺激聯(lián)合和不聯(lián)合50 ng/ml的雷帕霉素刺激mESCs 48 h后，收集細(xì)胞，提取蛋白，采用1.2.5中的方法繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，但一抗改為：Cyclin D1（1:500）和PCNA（1:500）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，用x±s表示，采用t檢驗(yàn)分析比較兩組間的顯著性差異，采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多組間分析。P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01 為差異有非常顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 mESCs的形態(tài) 在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的mESCs呈現(xiàn)出克隆狀生長(zhǎng)（圖1，見(jiàn)封二），細(xì)胞形態(tài)呈圓形或梭形，細(xì)胞體積較小，核質(zhì)比大，胞內(nèi)的細(xì)胞器稀少。

2.2 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)mESCs β1整合素和K19的表達(dá) 免疫熒光技術(shù)可以檢測(cè)到mESCs表達(dá)β整合素和K19，且陽(yáng)性率達(dá)到100%（圖2，見(jiàn)封二）。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34的表達(dá) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到第3代mESCs 陽(yáng)性表達(dá)CD34，且表達(dá)率高達(dá)99.8%（圖3）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mESCs CD34的表達(dá)

2.4 MTT法檢測(cè)H2O2刺激對(duì)mESCs增殖的影響 與對(duì)照組（H2O2濃度為0）比較，在不同低濃度H2O2刺激mESCs 48 h后，可觀察到只有25、50 μmol/L的H2O2對(duì)mESCs有明顯的促增殖作用（P＜0.05）；隨著H2O2濃度的增加，尤其是在150、200 μmol/L時(shí)細(xì)胞增殖受到明顯的抑制（P＜0.05）；而在不同低濃度H2O2刺激72 h時(shí)也可以觀察到相似的變化趨勢(shì)，只是在25和50 μmol/L時(shí)，其促增殖作用更為明顯（P ＜0.05，圖4）。

圖4 MTT法檢測(cè)H2O2刺激mESCs 48 h和72 h細(xì)胞的增殖

2.5 低濃度H2O2對(duì)Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

2.5.1 Akt和mTOR蛋白表達(dá)及其磷酸化水平的變化 不同低濃度H2O2刺激mESCs 48 h后，與對(duì)照組（H2O2濃度為0）比較，H2O2為25～100 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞總的Akt和mTOR蛋白表達(dá)均顯著增加 （P＜0.05或 P＜0.01），在H2O2濃度為150 μmol/L時(shí)，總Akt表達(dá)仍高于正常，但200 μmol/L濃度時(shí)，總Akt表達(dá)則低于正常，而總mTOR蛋白表達(dá)在這兩個(gè)濃度刺激下基本維持正常水平（圖5）。

圖5 Western Blot檢測(cè)低濃度H2O2刺激誘導(dǎo)mESCs細(xì)胞Akt和mTOR總蛋白表達(dá)的變化

H2O2濃度在25～100 μmol/L范圍時(shí)， p-mTOR和p-Akt蛋白的表達(dá)顯著增加（P ＜0.05），在H2O2濃度為150 μmol/L時(shí)，p-mTOR仍然維持高水平，而p-Akt基本降至正常水平；H2O2濃度為200 μmol/L時(shí)，兩者表達(dá)均與對(duì)照組（H2O20 μmol/L）一致(圖6)。

圖6 Western Blot檢測(cè)低濃度H2O2刺激誘導(dǎo)mESCs細(xì)胞p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)的變化

2.5.2 mTOR下游蛋白P70s6k、4E-BP1和eIF4E表達(dá)及其磷酸化水平的變化 與對(duì)照組比較，當(dāng)H2O2濃度為25～100 μmol/L時(shí)，mESCs細(xì)胞總P70s6k蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著性（P ＞0.05），但H2O2濃度為150～200 μmol/L時(shí)，其表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P ＜ 0.05）；總4E-BP1和總eIF4E蛋白表達(dá)在H2O2濃度為25～150 μmol/L時(shí)，均顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05或P ＜0.01），而H2O2濃度為200 μmol/L時(shí)，其表達(dá)水平接近對(duì)照組水平(圖7)。

圖7 Western Blot檢測(cè)低濃度H2O2刺激誘導(dǎo)mESCs細(xì)胞P70s6k、4E-BP1和eIF4E總蛋白表達(dá)的變化

在H2O2濃度為25～150 μmol/L時(shí)，p-P70s6k的表達(dá)水平呈逐漸增加趨勢(shì)且顯著高于對(duì)照（P＜0.05或P＜0.01），同樣p-4E-BP1和p-eIF4E蛋白表達(dá)也顯著高于對(duì)照（P ＜0.05或P＜0.01），提示此濃度范圍內(nèi)，H2O2顯示出對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路有活化作用。而當(dāng)H2O2濃度為200 μmol/L時(shí)，3個(gè)磷酸化蛋白的表達(dá)水平均分別低于對(duì)照組（P＜0.05或P ＜0.01），提示此濃度H2O2對(duì)細(xì)胞AKT/mTOR信號(hào)通路具有顯著抑制效應(yīng)（圖8）。

圖8 Western Blot檢測(cè)低濃度H2O2刺激誘導(dǎo)mESCs的p-P70s6k、p-4E-BP1和p-eIF4E蛋白表達(dá)的變化

2.6 MTT法檢測(cè)低濃度H2O2和雷帕霉素刺激對(duì)mESCs增殖的影響 為了進(jìn)一步探討低濃度H2O2對(duì)mESCs的促增殖作用是由AKT/mTOR信號(hào)通路活化所介導(dǎo)，我們通過(guò)mTOR蛋白抑制劑雷帕霉素與H2O2共同作用于mESCs，觀察其生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示：?jiǎn)为?dú)雷帕霉素（50 ng/ml）刺激細(xì)胞能顯著抑制細(xì)胞增殖（P ＜0.01），當(dāng)細(xì)胞同時(shí)受到不同濃度H2O2和50 ng/ml 雷帕霉素共同作用48 h后，與單獨(dú)各濃度H2O2刺激比較，mESCs的增殖明顯被抑制（P＜0.05或P＜0.01）。提示雷帕霉素能抑制低濃度H2O2誘導(dǎo)的mESCs增殖作用, H2O2誘導(dǎo)的mESCs增殖可能是通過(guò)Akt /mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)。(圖9)。

2.7 Western Blot檢測(cè)低濃度H2O2對(duì)細(xì)胞增殖周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 進(jìn)一步觀察H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和PCNA的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，50 μmol/L H2O2誘導(dǎo)能顯著誘導(dǎo)mESCs表達(dá)Cyclin D1和PCNA（P＜0.05或P＜0.01），雷帕霉素則抑制其表達(dá)（P ＜0.05）；同時(shí)加入H2O2和雷帕霉素處理細(xì)胞，與單獨(dú)50 μmol/L的H2O2作用相比，Cyclin D1和PCNA的表達(dá)顯著降低，提示mTOR 蛋白抑制劑雷帕霉素能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)H2O2誘導(dǎo)的mESCs增殖可能是通過(guò)活化Akt /mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)(圖10)。

圖9 MTT法檢測(cè)mTOR 蛋白抑制劑雷帕霉素(RAPA)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的mESCs增殖反應(yīng)的抑制作用

圖10 Western Blot檢測(cè)mTOR 蛋白抑制劑雷帕霉素（RAPA）對(duì)H2O2誘導(dǎo)的mESCs增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和PCNA表達(dá)的影響

3 討 論

臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度范圍的H2O2不僅能有效殺滅細(xì)菌，而且還能促進(jìn)創(chuàng)面愈合[1-2,8]，但其促愈機(jī)制尚不清楚。

H2O2是細(xì)胞內(nèi)主要的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)物之一，研究證實(shí)細(xì)胞內(nèi)適當(dāng)水平的ROS是維持干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移的前提[9-10]。有研究證實(shí)，低濃度的ROS被證實(shí)具有生長(zhǎng)因子樣作用的特性，低水平的H2O2和O2-能夠增加靜止細(xì)胞DNA的合成和誘導(dǎo)細(xì)胞c-fos和 c-myc基因表達(dá)上調(diào)，而這些基因都與細(xì)胞增殖相關(guān)[6]；此外，H2O2作為一種膜易透性、小分子化合物，能刺激細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路發(fā)揮更為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信使分子的作用[11]，在生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞（EC）遷移過(guò)程中，受體的活化能誘導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生，引起EC內(nèi)H2O2產(chǎn)生和蓄積而作為一種有效的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[2-4]；外源性H2O2能誘導(dǎo)EC內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活化[6-7]。因此，適當(dāng)濃度的H2O2對(duì)于維持EC存活、生長(zhǎng)和遷移以及促進(jìn)血管生成都是必需的。這可能是低濃度H2O2促愈機(jī)制之一。

mESCs是維持皮膚新陳代謝的主要功能細(xì)胞，也是皮膚創(chuàng)傷修復(fù)發(fā)揮著重要作用的效應(yīng)細(xì)胞。由于低濃度H2O2具有創(chuàng)面促愈效應(yīng)[1-3,8]，因此，本研究探討低濃度H2O2對(duì)mESCs增殖的影響，以進(jìn)一步闡明其促愈機(jī)制。

我們通過(guò)酶消化法分離獲得小鼠mESCs，相差顯微鏡下觀察其呈克隆性生長(zhǎng)，細(xì)胞體積小，核質(zhì)比大，包內(nèi)細(xì)胞器稀少。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果提示分離培養(yǎng)的細(xì)胞是皮膚表皮干細(xì)胞。

本研究發(fā)現(xiàn)低濃度的H2O2(25 μmol/L和50 μmol/L)作用48和72h后，能顯著促進(jìn)mESCs增殖，但當(dāng)H2O2濃度增加到150和200μmol/L時(shí)，則顯示細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。由此提示低濃度H2O2對(duì)表皮干細(xì)胞有促增殖作用。由于Akt/mTOR 信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)中處于核心地位，它參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期和DNA損傷修復(fù)等過(guò)程，為了闡明低濃度H2O2對(duì)mESCs的促增殖作用是否依賴于Akt/mTOR信號(hào)通路的活化，我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)體系中同時(shí)加入mTOR蛋白抑制劑雷帕霉素，結(jié)果顯示雷帕霉素能對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的mESCs的增殖效應(yīng)，由此提示H2O2促進(jìn)mESCs細(xì)胞增殖可能依賴于Akt/mTOR信號(hào)通路的活化。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是感受營(yíng)養(yǎng)信號(hào)、在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖中起著關(guān)鍵作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，活化的mTOR促進(jìn)其下游信號(hào)分子P70s6k和4E-BP1的磷酸化活化，進(jìn)而引起真核翻譯起始因子（the eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E）磷酸化活化，最終導(dǎo)致促進(jìn)靶蛋白的翻譯起始[5-6]。有研究表明，mTOR是維持皮膚內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵信號(hào)通路，同時(shí)也是維持細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和血管發(fā)生的重要調(diào)控元件[5]。為此，我們進(jìn)一步觀察了低濃度H2O2對(duì)Akt/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)與磷酸化活化的影響,結(jié)果提示,低濃度H2O2（25～100 μmol/L）能顯著上調(diào)Akt/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白如Akt、mTOR、P70s6k、4E-BP1和eIF4E的表達(dá)及其磷酸化水平，促進(jìn)了此信號(hào)通路的活化。由于此通路參與了細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控，與細(xì)胞增殖周期關(guān)系密切，進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果提示，在低濃度H2O2作用下，伴隨著Akt/ mTOR信號(hào)通路的活化，細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達(dá)也明顯上調(diào)，而雷帕霉素能對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的cyclin D1和PCNA表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)一步提示H2O2促表皮干細(xì)胞增殖依賴于Akt/mTOR信號(hào)通路的活化。

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，低濃度H2O2的促愈效應(yīng)的機(jī)制之一，可能是通過(guò)促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增殖而實(shí)現(xiàn)，而低濃度H2O2促表皮干細(xì)胞增殖的活性則依賴于AKT/mTOR信號(hào)通路的活化。

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Akt/mTOR pathway mediates the proliferation of murine epidermal stem cells following low concentration of hydrogen peroxide treatment

Qi Junhua*, Nie Gang, Wu Mei, Liu Xiaoping, Chen Minjia, Zhu Ming, Yuan Peisong, Zhang Ya , Song Yuqing, Guo Wei, Xing Wei, Li Xiangyun, Luo Donglin, Huang Hong, Xu Xiang.
*State Key Laboratory of Trauma, Burn and Combined Injury, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China

Huang Hong(E-mail:huanghongcq@163.com)

Objective:To investigate the effect of a low concentration of hydrogen peroxide (H2O2) on the proliferation of murine epidermal stem cells (mESCs) and its mechanism. Methods: The mESCs were isolated with trypsin and type I collagen enzyme digestion. The mESCs were identified using β1 integrin, keratin 19 (K19) and CD34 antibody with immunofluorescence detection technique and flow cytometry analysis. The mESCs were treated with different concentrations of H2O2(0, 25, 50, 100, 150 and 200 μmol/L) for 48 hours and 72 hours, and in another experiment, the mESCs were treated with low concentrations of H2O2(0, 25, 50, 100, 150 μmol/L) alone or combined with 50 ng/ml rapamycin (Rapa) for 48 hours. The proliferation of mESCs was detected by MTT analysis, and the expression of key proteins such as mTOR, Akt, P70s6k, eIF4E,4E-BP1, p-Akt, p-mTOR, p-P70s6k,p-4E-BP1 and p-eIF4E in the Akt/mTOR signaling pathway was assayed using Western blotting after mESCs treated with different concentrations of H2O2for 48 hours. The expression of cell cycle protein cyclin D1 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were also determined using Western blotting. Results: The results showed that 100% of the mESCs expressed β1 integrin and K19， and 99.8% of them expressed CD34, thereby mESCs were comfirmed. The proliferation of mESCs was makedly increased 48 and 72 hours after H2O2treatment at the dose of 25 μmol/L and 50 μmol/L（P ＜0.05）, and this proliferation effect as induced by H2O2was antagonized by rapamycin. However, the proliferation of mESCs was inhibited markedly after treatment with 200 μmol/L H2O2for 48 hours and 72 hours (P ＜0.05), Furthermore, after mESCs were treated with H2O2in a concentration of 25 μmol/L to 150 μmol/L, the Akt/mTOR pathway was activated, characterized by a marked increase of expression of total and phosphorylated key proteins ( p-mTOR, p-4E-BP1 and p-eIF4E) in this pathway(P ＜0.05 or P ＜0.01), but the expression of these proteins was dramatically attenuated after being treated with 200 μmol/L of H2O2(P ＜0.05 or P ＜0.01). In addition, the expression of cell cycle protein cyclin D1 and PCNA were increased (P＜0.05) after being treated with 50 μmol/ L H2O2, and it was antagonized by treatment of rapamycin. Conclusions: Low concentration of H2O2can promote the proliferation of mESCs, and it activates the Akt/mTOR pathway. The mESCs proliferation induced by low concentration H2O2is partly dependant on the Akt/mTOR pathway activation.

Epidermal stem cells Hydrogen peroxide The Akt/mTOR pathway Proliferation

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 03. 003

Xu Xiang(E-mail:xiangxu@ymail.com)

2015-04-03)

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （81372059，81372060）; 國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(2012GB518105)

黃宏，教授（E-mail: huanghongcq@163.com）; 徐祥，教授（E-mail:xiangxu@ymail.com）