張鵬飛，徐成成，李文磊，郭海英

電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白和神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43表達(dá)的影響①

張鵬飛1，徐成成2，李文磊2，郭海英1

目的探討電針對(duì)胡須體覺(jué)皮層局灶性腦缺血大鼠10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白(PTEN)和神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(GAP-43)表達(dá)的影響。方法24只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠分為假手術(shù)組(n=8)、模型組(n=8)及電針組(n=8)。于造模成功后第3天，電針組予電針百會(huì)(DU20)和風(fēng)府(DU16)30 min，每天1次。造模前1 d，給藥后3 d、7 d和14 d，應(yīng)用角落測(cè)試進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)；給藥后14 d采用Western blotting檢測(cè)梗死周邊區(qū)PTEN、GAP-43蛋白的表達(dá)。結(jié)果電針組向右轉(zhuǎn)的次數(shù)較模型組顯著下降(P＜0.001)。模型組GAP-43表達(dá)較假手術(shù)組升高(P＜0.05)，電針組較模型組升高(P＜0.05)。模型組PTEN表達(dá)與假手術(shù)組無(wú)顯著性差異(P=0.460)，電針組較模型組顯著降低(P＜0.001)。結(jié)論電針可能通過(guò)抑制PTEN和增加GAP-43的表達(dá)促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。

腦缺血；電針；神經(jīng)再生；10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白；生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43；大鼠

[本文著錄格式]張鵬飛，徐成成，李文磊，等.電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白和神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(1):35-38.

CITED AS:Zhang PF,Xu CC,Li WL,et al.Effects of electroacupuncture on expressions of phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten and growth associated protein 43 in rats with barrel cortex ischemia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21 (1):35-38.

缺血性腦血管疾病是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重要疾病，是導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因，但是治療方法相當(dāng)有限，其最有效的治療方法就是發(fā)病3～6 h內(nèi)急性溶栓治療。然而由于各種原因的限制，只有近1%的患者能夠進(jìn)行有效溶栓治療[1-2]。目前認(rèn)為，促進(jìn)神經(jīng)組織再生修復(fù)是腦缺血后唯一長(zhǎng)期有效的治療方法。

針灸廣泛應(yīng)用于腦卒中的治療，臨床療效肯定，對(duì)腦卒中引起的功能損傷，如偏癱、吞咽困難、失語(yǔ)、尿失禁和抑郁等的治療中療效顯著[3-7]，但其作用機(jī)制尚不清楚。10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)基因作為一種腫瘤抑制基因，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)發(fā)生和再生過(guò)程中起重要作用，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟過(guò)程中軸突生長(zhǎng)和再生能力逐漸下降的一個(gè)非常重要的內(nèi)在控制分子，抑制PTEN能明顯促進(jìn)成熟神經(jīng)系統(tǒng)再生修復(fù)[8]。神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43( growth associated protein 43,GAP-43)是一種胞膜磷酸蛋白質(zhì)，是一種神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，廣泛存在于神經(jīng)組織中，在生長(zhǎng)、分化和再生的軸突末端以及突觸前膜含量極高，主要參與神經(jīng)細(xì)胞外生長(zhǎng)及突觸發(fā)育形成和神經(jīng)細(xì)胞再生[9-11]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察電針對(duì)胡須體覺(jué)皮層局灶性腦缺血大鼠胡須功能的恢復(fù)以及腦梗死周邊區(qū)組織PTEN和GAP-43蛋白的表達(dá)情況，探究電針對(duì)腦缺血后神經(jīng)再生修復(fù)的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量(200±20)g，由江蘇省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，標(biāo)準(zhǔn)化環(huán)境飼養(yǎng)。

G6805電針儀：上海華誼醫(yī)用儀器有限公司。DYY-7C型電泳儀：北京市六一儀器廠(chǎng)。TY-80S型脫色搖床：普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所。KDC-140HR型高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。立式高壓滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。BioSpectrum凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)UVP公司。分光光度計(jì)：德國(guó)EPPENDORF公司；熒光激發(fā)濾過(guò)成像系統(tǒng)(LSM-GB200激光共聚焦顯微鏡、Dage-CCD-72攝像機(jī))：日本Olympus。PeriFlux System 5000-PF5010 LDPMunit激光多普勒腦血流儀：瑞典PERIMED公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海碧云天公司。se-2005羊抗鼠IgG-HRP、sc-2004羊抗兔IgG-HRP：SANTA CRUZ公司。鼠β-Actin單克隆抗體、兔PTEN單克隆抗體、兔GAP-43單克隆抗體：CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模

參照文獻(xiàn)[12]建立胡須體覺(jué)皮層局灶性腦缺血模型。大鼠10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，左側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。顯微鏡下靠近眶后切開(kāi)右顳側(cè)皮膚及顳肌，鈍性分離肌肉組織，暴露右側(cè)顳骨。手術(shù)電鉆在前囟水平距中線(xiàn)右側(cè)4.1 mm處(ML+4.1 mm)開(kāi)一個(gè)3～4 mm的顱骨窗，保持硬腦膜完整。刺激對(duì)側(cè)胡須，應(yīng)用熒光激發(fā)濾過(guò)成像系統(tǒng)檢測(cè)內(nèi)在光信號(hào)(IOS)、激光多普勒腦血流儀測(cè)定刺激前后局部腦血流，確定胡須體覺(jué)皮質(zhì)。11.0手術(shù)線(xiàn)穿過(guò)硬腦膜，結(jié)扎胡須體覺(jué)皮質(zhì)周?chē)?～3支大腦中動(dòng)脈分支，同時(shí)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 min，局部血管成像信號(hào)消失，刺激對(duì)側(cè)胡須，血管信號(hào)無(wú)反應(yīng)，說(shuō)明選擇并結(jié)扎了正確的血管，造模成功。縫合皮膚。

3 d后將造模大鼠分為電針組8只與模型組8只。假手術(shù)組8只大鼠處理過(guò)程同造模大鼠，但不結(jié)扎大腦中動(dòng)脈分支。

1.2.2 電針

自制大鼠固定器，在不麻醉、清醒狀態(tài)下固定大鼠，盡量不妨礙大鼠的生理活動(dòng)。大鼠電針穴位定位參考文獻(xiàn)[13]，取百會(huì)(DU20)、風(fēng)府穴(DU16)。電針組大鼠俯臥位固定，“華佗牌”不銹鋼針直徑0.30 mm，長(zhǎng)25 mm，常規(guī)消毒，斜刺9～10 mm，接G6805電針儀，施以連續(xù)波，強(qiáng)度以針柄輕度抖動(dòng)為度，每天1次，每次30 min，共14 d。模型組只捆綁固定，不電針。

1.3 行為學(xué)檢測(cè)

采用角落測(cè)試(Corner Test)[14]，分別于造模前1 d，給藥后3 d、7 d和14 d進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。將大鼠放入一端封閉，由兩塊30×20×1 cm平板構(gòu)成的30°夾角(corner)內(nèi)，將一塊底邊長(zhǎng)16 cm，腰長(zhǎng)30 cm的等腰三角形板覆蓋于夾角上，在夾角上半部留15×1 cm縫隙。當(dāng)大鼠進(jìn)入夾角深部，雙側(cè)的觸須將受到刺激，大鼠將站立轉(zhuǎn)身或貼地轉(zhuǎn)身(頭部從腹部下方鉆過(guò)的屈曲轉(zhuǎn)身)面向夾角開(kāi)口端。每只大鼠做10次，計(jì)算左轉(zhuǎn)、右轉(zhuǎn)次數(shù)。正常大鼠向左向右轉(zhuǎn)身的次數(shù)基本相等，右側(cè)腦缺血大鼠向右側(cè)(病灶側(cè))轉(zhuǎn)身的次數(shù)明顯增加。

1.4 Western blotting檢測(cè)

給藥后14 d，斷頭處死大鼠并取出梗死區(qū)周邊腦組織。提取組織蛋白，應(yīng)用Eppendorf分光光度計(jì)測(cè)

出樣品中濃度。0.01 mol/L PBS(pH=7.4)稀釋所有樣品至4 μg/μl。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF，放入封閉緩沖液中室溫封閉1 h。分別進(jìn)行一抗及二抗孵育：一抗在-4℃冰箱中搖床過(guò)夜，取出后用TBST搖床清洗6次，每次10 min；之后加入二抗，在37℃孵育箱內(nèi)孵育2 h。按試劑盒要求配制化學(xué)發(fā)光試劑，滴加在膜上，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析目的蛋白的表達(dá)。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度測(cè)定。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與β-actin比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以(ˉ±s)表示，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測(cè)

假手術(shù)組和造模各組造模前1 d向左、向右貼地轉(zhuǎn)身概率接近。術(shù)后3 d，電針組與模型組向右側(cè)轉(zhuǎn)身次數(shù)較假手術(shù)組明顯增多(P＜0.001)。術(shù)后7 d，電針組與模型組右轉(zhuǎn)次數(shù)較3 d有所下降，電針組與模型組比較無(wú)顯著差異(P=0.083)。術(shù)后14 d，電針組右轉(zhuǎn)次數(shù)較模型組顯著下降(P＜0.001)，接近假手術(shù)組水平(P=0.038)。假手術(shù)組大鼠不論何時(shí)向左、向右轉(zhuǎn)的概率均接近。見(jiàn)表1。

表1 各時(shí)間點(diǎn)各組右轉(zhuǎn)次數(shù)比較

2.2 Western blotting檢測(cè)

模型組GAP-43表達(dá)較假手術(shù)組升高(P＜0.05)，電針組GAP-43表達(dá)較模型組及假手術(shù)組均升高(P＜0.05)。模型組PTEN表達(dá)較假手術(shù)組無(wú)顯著性差異(P=0.460)，電針組PTEN表達(dá)較模型組及假手術(shù)組均顯著降低(P＜0.001)。見(jiàn)表2。

表2 PTEN與GAP-43蛋白表達(dá)情況(/β-actin)

3 討論

缺血性腦卒中發(fā)生后，大量神經(jīng)細(xì)胞死亡和凋亡，相應(yīng)神經(jīng)元的突觸聯(lián)系中斷；若要恢復(fù)其功能，必須恢復(fù)其突觸聯(lián)系。電針在功能缺損的康復(fù)方面效果顯著。有研究顯示，電針可以使缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)GAP表達(dá)增多、提高腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)等[15-16]，從而對(duì)受損的神經(jīng)元軸突起到保護(hù)以及促進(jìn)再生作用。

本研究選用的百會(huì)穴(DU20)與風(fēng)府穴(DU16)均為督脈穴位，有醒腦開(kāi)竅，填髓益腦，寧神定志的作用。督脈總督一身之陽(yáng)，與諸陽(yáng)脈相連，有“陽(yáng)脈之海”之稱(chēng)。針刺督脈可以疏通陽(yáng)經(jīng)經(jīng)氣，培補(bǔ)真陽(yáng)。督脈循行與脊里，入絡(luò)于腦，與腦的關(guān)系極為密切，對(duì)大腦功能的調(diào)節(jié)起著重要作用。

PTEN是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的同時(shí)具有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制基因。PTEN通過(guò)其脂質(zhì)磷酸酶活性作用于磷脂酰肌醇3激酶(phosphotidylinositol 3-kinase,PI3K)的下游靶分子三磷酸肌醇酯(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3)，從而阻斷PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)廣泛，不僅參與神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的調(diào)節(jié)，而且在神經(jīng)的發(fā)生和神經(jīng)再生過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。Park等在視神經(jīng)損傷模型中，首次應(yīng)用活體內(nèi)條件性基因敲除PTEN，通過(guò)重新激活A(yù)kt/mTOR/S6K通路而實(shí)現(xiàn)視神經(jīng)顯著再生[8]。

本研究顯示，電針可以抑制半暗區(qū)PTEN蛋白表達(dá)，對(duì)神經(jīng)再生有一定促進(jìn)作用。同時(shí)行為學(xué)測(cè)試在一定程度上也說(shuō)明電針可改善大鼠的體感-運(yùn)動(dòng)功能。

GAP-43在神經(jīng)元發(fā)育和再生過(guò)程中高水平表

達(dá)，是一種重要的神經(jīng)生長(zhǎng)和再生的分子標(biāo)志物[17-19]。它主要通過(guò)聚集f-肌動(dòng)蛋白，將生長(zhǎng)錐附著、固定，使細(xì)胞變形，以利于生長(zhǎng)錐延伸，從而促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。本研究顯示，電針在一定程度促進(jìn)大鼠梗死區(qū)周?chē)鶪AP-43表達(dá)，可能會(huì)促進(jìn)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)及再生，對(duì)受損神經(jīng)有一定恢復(fù)作用。

綜上所述，行為學(xué)檢測(cè)與組織學(xué)研究結(jié)果均表明，電針百會(huì)和風(fēng)府可以促進(jìn)大鼠胡須功能的恢復(fù)，其作用機(jī)制可能是抑制梗死灶周邊區(qū)PTEN表達(dá)、上調(diào)GAP-43表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)突觸再生。

[1]Rymner MM,Akhtar N,Martin C,et al.Management of acute ischemic stroke:time is brain[J].Mo Med,2010,107(5): 333-337.

[2]Fisher M.New approaches to neuroprotective drug development[J].Stroke,2011,42(1):24-27.

[3]宋豐軍,蔣松鶴,鄭士立,等.電針治療中風(fēng)后尿失禁:多中心隨機(jī)對(duì)照研究[J].中國(guó)針灸,2013,33(9):769-773.

[4]黎小慧,陳俊琦,王惠庭,等.電針與抗抑郁藥治療中風(fēng)后抑郁癥比較的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2012,15(3A):802-806.

[5]王秋云.按期分經(jīng)電針?lè)ㄖ委熤酗L(fēng)后偏癱療效觀(guān)察[J].中國(guó)針灸,2006,26(1):33-35.

[6]張智龍,趙淑華,陳國(guó)華,等.深刺崇骨穴為主治療中風(fēng)后吞咽困難:隨機(jī)對(duì)照研究[J].中國(guó)針灸,2011,31(5):385-390.

[7]梁潔玲.針刺加脈沖電針治療中風(fēng)后失語(yǔ)60例[J].廣西中醫(yī)藥,2010,33(2):30-31.

[8]Park KK,Liu K,Hu Y,et al.Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway[J]. Science,2008,322(5903):963-966.

[9]齊首楠,蘇冠方,王晨光,等.GAP-43在新生大鼠視網(wǎng)膜及其誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)[J].眼科新進(jìn)展,2010,30(9):801-804.

[10]劉廣義.大鼠腦缺血再灌注損傷后GAP-43及IGF-1在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2008,7(3): 223-226.

[11]Donnelly CJ,Park M,Spillane M,et al.Axonally synthesized β-actin and GAP-43 proteins support distinct modes of axonal growth[J].J Neurosci,2013,33(8):3311-3322.

[12]李文磊,姜亞軍,閔敏,等.小鼠胡須體覺(jué)皮質(zhì)局灶性腦缺血模型建立[J].中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué),2011,19(4):357-362.

[13]李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2003: 327-329.

[14]Zhang L,Schallert T,Zhang ZG,et al.A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia[J].J Neurosci Methods,2002,117(2):207-214.

[15]韓永升,韓詠竹,徐磊,等.電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43和Nogo-A表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(2):119-123.

[16]葉曉倩,江一靜,游詠梅,等.電針對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2014, 29(3):204-207.

[17]帖利軍,潘建平,宋天保,等.GAP-43在發(fā)育大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)[J].西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2001,22(6):499-501.

[18]鄧志云.GAP-43的研究進(jìn)展及其與周?chē)窠?jīng)再生的關(guān)系[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào),2012,52(6):94-96.

[19]Denny JB.Molecular mechanisms,biological actions,and neuropharmacologyofthegrowth-associatedprotein GAP-43[J].Curr Neuropharmacol,2006,4(4):293-304.

Effects of Electroacupuncture on Expressions of Phosphatase and Tensin homology Deleted on Chromosome Ten and Growth Associated Protein 43 in Rats with Barrel Cortex Ischemia

ZHANG Peng-fei,XU Cheng-cheng,LI Wen-lei,GUO Hai-ying.Nanjing University of Traditional Chinses Medicine,Nanjing,Jiangsu 210029,China

Objective To investigate the effects of electroacupuncture(EA)on expression of phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten(PTEN)protein and growth associated protein-43(GAP-43)in rats with Barrel cortex focal ischemia.Methods 24 adult male Sprague-Dawley rats were divided into sham group(n=8),model group(n=8)and EA group(n=8).The EA group accepted EA at Baihui(DU20)and Fengfu(DU16)acupoints 3 days after modeling,30 min a time,once a day.They were assessed with Corner Test 1 day before modeling,and 3 days,7 days and 14 days after medication.The expression of GAP-43 and PTEN around infarct zone were detect with Western blotting 14 days after medication.Results The frequence of turn-right decreased in the EA group compared with that in the model group(P＜0.001)14 days after modeling.The expression of GAP-43 increased in the model group compared with that in the sham group(P＜0.05),and increased more in the EA group than in the model group(P＜0.05).There was no significantly difference in PTEN expression between the model group and the sham group(P=0.460),and significantly decreased in the EA group(P＜0.001).Conclusion EA may inhibit expression of PTEN protein and increase expression of GAP-43,which may be involved in nerve regeneration and functional recovery.

cerebral ischemia;electroacupuncture;nerve regeneration;phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten; growth associated protein 43;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.009

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0035-04

2014-10-09

2014-12-26)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81100907)。

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京市210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院江蘇省中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇南京市210029。作者簡(jiǎn)介：張鵬飛(1987-)，男，漢族，內(nèi)蒙古赤峰市人，碩士研究生，主要研究方向：腦血管疾病的中醫(yī)康復(fù)治療。通訊作者：李文磊，女，博士，主治醫(yī)師；郭海英，女，博士生導(dǎo)師，教授。E-mail:liwenlei80@163.com；ghying63@126.com。