江 嶠，程邦寧

(安徽省立兒童醫(yī)院檢驗(yàn)中心，安徽合肥 230051)

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection，ARI)是兒科常見(jiàn)病，是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的首要病因，有報(bào)道全世界每年死于ARI兒童有近350萬(wàn)例，90%為社區(qū)獲得性肺炎［1］。目前證實(shí)多數(shù)急性上、下呼吸道感染是由病原體引起，最為常見(jiàn)的為病毒感染［2］。病原學(xué)上呼吸道感染在不同的國(guó)家、地區(qū)、季節(jié)和患兒年齡等不同，ARI病因?qū)W診斷和治療手段有賴于病原學(xué)檢測(cè)［3］，因此，快速而準(zhǔn)確的診斷呼吸道感染病原體對(duì)于適時(shí)調(diào)整治療方案、選擇窄譜抗菌藥物、患兒預(yù)后和采取必要的隔離防護(hù)措施非關(guān)鍵。臨床上，實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)手段包括痰涂片、痰培養(yǎng)、血清免疫學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)等。針對(duì)患兒血清特異抗體進(jìn)行血清免疫學(xué)因檢測(cè)取材和操作簡(jiǎn)便，易于標(biāo)準(zhǔn)化而廣泛應(yīng)用。間接免疫熒光法(immunofluorescence assay，IFA)兩步結(jié)合放大作用，敏感度明顯高于直接免疫熒光法，目前，該法已廣泛用于臨床診斷。本研究應(yīng)用IFA聯(lián)合檢測(cè)患兒血清中病原體，通過(guò)回顧性分析本地區(qū)兒童呼吸道疾病病原學(xué)特點(diǎn)，為進(jìn)一步了解安徽省ARI住院患兒的病原譜，掌握ARI患兒病原的流行病學(xué)特性、年齡和季節(jié)分布，為臨床合理用藥治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇安徽省立兒童醫(yī)院2013年1月—2014年1月0～15歲兒童因上、下急性呼吸道疾病(包括扁桃體炎、咽峽炎、肺炎、支氣管哮喘等)住院治療的患兒為研究對(duì)象，共16 388例?；純杭膊〉脑\斷均符合胡亞美主編的《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第7版的ARI診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究患兒家長(zhǎng)簽署知情同意書，均通過(guò)安徽省立兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查。

1.2 標(biāo)本采集和病原體的檢測(cè) 患兒入院24 h內(nèi)采集2 mL肘靜脈血，3 000 rpm離心10 min，收集血清，－20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)錅y(cè)。試劑盒由鄭州安圖綠科生物工程有限公司提供，采用西班牙VIRCELL公司生產(chǎn)的PENUMOSLIDE－IgM呼吸道九聯(lián)檢試劑盒，使用美國(guó)奧林帕斯公司生產(chǎn)的熒光顯微鏡，應(yīng)用間接熒光免疫法，同時(shí)檢測(cè)患兒血清中的9種病原體IgM類特異性抗體，包括:嗜肺軍團(tuán)菌I型、肺炎支原體、Q熱立克次體、肺炎衣原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒甲型、流感病毒乙型、副流感1、2、3型，待檢測(cè)樣本中的IgM抗體與吸附在載玻片的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，再與熒光素標(biāo)記物的抗人球蛋白發(fā)生反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物IgM-FITC復(fù)合物，最后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，根據(jù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)判斷檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床狀況 16 388例ARI患兒中，男性10 357例，女性6 031 例，男∶女 =1.72∶1。年齡范圍:3 d ～14 歲(中位年齡為13月齡)。ARI患兒中，5 061例1～6月齡、3 713例7月齡 ～1歲、3 802例2～3歲、1 945例4～5歲、1 867例6歲及以上。16 388例ARI患兒疾病分組:826例上呼吸道感染、351例喉炎、1 607例支氣管炎、3 952例毛細(xì)支氣管炎、7 056例支氣管肺炎、904例大葉性肺炎、587例間質(zhì)性肺炎、1 105例哮喘急性發(fā)作。

2.2 病原檢出情況 16 388例ARI患兒中，共有4 396例(檢出率26.84%)患兒標(biāo)本至少有1種病原檢測(cè)陽(yáng)性，其中，2 106 例(47.91%)為病毒檢測(cè)陽(yáng)性、2 276 例(51.77%)為不典型病原體檢測(cè)陽(yáng)性;同時(shí)感染模式多樣，合并有二種以上病原體2 378例(14.51%)，二種或以上病原體合并感染既有病毒與病毒合并感染，也有病毒和(或)細(xì)菌、不典型病原體合并感染。4 396例檢出病原體的患兒中，占前3位病原體是肺炎支原體、乙型流感病毒和腺病毒。安徽省ARI患兒中常見(jiàn)5種的病原體感染情況見(jiàn)表1。

2.3 三種主要病原在不同年齡患兒檢出情況 觀察三種主要病原菌在不同患兒年齡分布特點(diǎn)(表2)，由表2可見(jiàn)不同年齡段的患兒好發(fā)不同病原菌的感染，支原體肺炎陽(yáng)性感染在不同年齡組檢出率中，隨患兒年齡的增加而呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在3～6歲年齡時(shí)達(dá)高峰922例(40.55%)，隨患兒年齡增長(zhǎng)有逐漸下降趨勢(shì)。乙型流感病毒陽(yáng)性感染檢出率最高為1～3歲、3～6歲齡組，分別為 462例(25.67%)、527例(29.28%)，6歲后感染明顯降低。腺病毒在嬰兒組(≤6月齡)和幼兒組(7月齡～1歲)檢出率較高，分別為87例(33.85%)和92 例(35.79%)。

表1 安徽省ARI患兒中的病原體感染情況

表2 三種主要病原菌在不同年齡ARI患兒中的檢出情況［n(%)］

2.4 三種主要病原菌感染的季節(jié)分布特點(diǎn) 不典型病原肺炎支原體常年流行，其中夏季檢出率最高，達(dá)39.18%(891/2 274)，檢出最高月為7月，檢出為426例。乙型流感病毒感染有明顯的季節(jié)性，好發(fā)于秋冬季(10月至次年3月，共1367例)，檢出最高月(12月、次年1月)高達(dá)472例(26.22%)和426例(23.67%)。腺病毒感染也有明顯的季節(jié)性，好發(fā)于冬春季，檢出最高月為1月，檢出率為46例(17.89%)。三種主要病原菌在不同季節(jié)ARI患兒中檢出情況見(jiàn)表3。另本研究觀察到，病毒檢出陽(yáng)性率在冬春季較高，在1月份達(dá)高峰，而夏季不典型病原肺炎支原體較高，在7月最高。

表3 三種主要病原菌在不同季節(jié)的ARI患兒中檢出情況［n(%)］

3 討論

急性呼吸道感染(ARI)屬于兒童時(shí)期的常見(jiàn)病，特別是下呼吸道的感染，有報(bào)道ARI患兒占兒科住院患兒的72.3%［4］。本研究表明，我省兒童急性呼吸道感染最常見(jiàn)的病原仍然是病毒感染，其次的致病病原體為細(xì)菌和不典型感染，本次，共檢出4 396例患兒標(biāo)本至少有1種病原檢測(cè)陽(yáng)性，檢出率26.84%。而且，感染模式多樣，合并有二種以上病原體混合感染為2 378例(14.51%)。本次研究總病原檢出率、病毒、細(xì)菌感染率低于季偉等［5］報(bào)道的蘇州地區(qū)，而不典型病原體檢測(cè)陽(yáng)性高于蘇州地區(qū)，可能與本研究期限僅為1年，流行年份處于不典型病原體感染活動(dòng)期。

目前快速診斷呼吸道病原菌通常是檢測(cè)病原菌特異性抗原，可以通過(guò)直接免疫熒光法(DFA)，檢測(cè)患兒的鼻咽分泌物標(biāo)本，但此種檢查容易污染，對(duì)操作者技術(shù)水平要求較高。病原菌感染發(fā)病后1周內(nèi)患兒血清往往可以檢測(cè)到特異性的IgM，對(duì)于ARI患兒，急性期進(jìn)行病原診斷有重要的參考價(jià)值，而且采集血清標(biāo)本對(duì)操作者技術(shù)水平要求不高，可以更好的反映患兒病原感染情況。但因?yàn)锳RI潛伏期短和反復(fù)感染等特點(diǎn)，導(dǎo)致病原菌尤其是不典型病原體特異性IgM抗體的滴度檢測(cè)受影響［6］。目前檢測(cè)呼吸道病原感染方法較多，但都存在不足;而且，病毒分離培養(yǎng)時(shí)間較久，常有假陰性;病原的核酸檢測(cè)靈敏度雖然高，但易被污染而存在假陽(yáng)性;ELISA檢測(cè)特異性IgG陽(yáng)性只能說(shuō)明相應(yīng)病原感染，不能進(jìn)行早期感染判斷和療效監(jiān)測(cè)［7］。血清免疫學(xué)檢測(cè)主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫印跡法、間接免疫熒光法(IFA)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等。IFA法兩步結(jié)合的放大作用，使其敏感度明顯高于DFA法，IFA法已經(jīng)廣泛用于研究和臨床診斷，故本研究應(yīng)用 IFA結(jié)合ELISA，對(duì)16 388例ARI急性期兒童的血清進(jìn)行呼吸道病毒特異性IgM抗體的檢測(cè)，結(jié)合臨床資料進(jìn)行探討、解讀檢測(cè)結(jié)果。對(duì)兒童呼吸道病毒感染臨床及流行病學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行回顧性分析，為臨床病毒病原學(xué)診斷、治療提供依據(jù)并指導(dǎo)合理用藥。

通過(guò)本次研究，我們發(fā)現(xiàn)本地區(qū)2013年前3位病原體分別是肺炎支原體、乙型流感病毒和腺病毒。分析3種主要病原菌在不同患兒年齡分布發(fā)現(xiàn)，病毒在嬰幼兒組檢出率較高，不同年齡段的患兒好發(fā)不同病原菌的感染，乙型流感病毒好發(fā)于學(xué)年前兒童，尤其是幼兒園階段;腺病毒陽(yáng)性感染檢出最高為小于1周歲齡組，當(dāng)兒童年齡超過(guò)6歲時(shí)，病毒感染明顯有下降趨勢(shì)。而肺炎支原體陽(yáng)性感染在不同年齡組檢出率中，從嬰幼兒到學(xué)齡前，隨患兒年齡的增加呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在幼兒園階段(3～6歲)年齡時(shí)達(dá)高峰。另本研究觀察到，乙型流感病毒、腺病毒病毒檢出陽(yáng)性率在秋冬季較高，在1月份達(dá)高峰，而夏季病毒陽(yáng)性檢出率較低。不典型病原支原體肺炎常年流行，其中夏季檢出率最高。這種病毒感染、不典型病原季節(jié)性的改變可能是由各地氣候差異因素引起，對(duì)這些病原體的流行和季節(jié)性起相當(dāng)重要的作用［8］。

本研究表明，16 388例患兒中二種以上病原體同時(shí)感染模式多樣，合并有二種以上病原體感染的患兒有2 378例，不同部位疾病的治病的病原譜稍有不同。呼吸道病原體混合感染模式多樣，通過(guò)對(duì)不同的混合感染病因，對(duì)臨床早期診斷治療具有重要的指導(dǎo)作用。肺炎支原體感染是本市ARI最常見(jiàn)的病原，故不典型病原體的作用不容忽視。如何及時(shí)準(zhǔn)確的判斷病原感染，實(shí)現(xiàn)靶向治療，仍然是目前臨床面臨的重要課題［9］。目前對(duì)病毒和非典型病原體的分離、培養(yǎng)和鑒定能力在我省大部分醫(yī)院的臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室仍然有限，臨床主要選擇廣譜抗菌藥物的經(jīng)驗(yàn)治療為主，缺乏針對(duì)性，導(dǎo)致臨床上耐藥菌的產(chǎn)生，增加治療的難度。因此，針對(duì)患兒血清特異抗體進(jìn)血清學(xué)免疫的IFA、ELISA檢測(cè)，再結(jié)合患兒臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行有效的病原學(xué)檢測(cè)，可以適時(shí)的指導(dǎo)臨床調(diào)整治療方案，選擇窄譜抗菌藥物，減少抗菌藥物在病毒感染中的非必須使用。當(dāng)然，為防止臨床檢驗(yàn)實(shí)踐工作中漏檢，應(yīng)加強(qiáng)多檢測(cè)手段的聯(lián)合使用，同時(shí)檢測(cè)患者的血清樣本、咽拭子、痰液涂片，以及其他分泌物檢測(cè)，為臨床提供客觀而全面的病原學(xué)檢查結(jié)果。

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