孫露銀(綜述)，閆彩鳳(審校)

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 揚(yáng)州 225001)

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殼聚糖促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞吸收的機(jī)制

孫露銀△(綜述)，閆彩鳳※(審校)

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 揚(yáng)州 225001)

摘要：多肽和蛋白質(zhì)類藥物具有高效、低毒及藥物間相互作用小的特性，使得它們?cè)絹?lái)越多地應(yīng)用于臨床。胃腸道在人體和外界之間形成了一個(gè)選擇性屏障，允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水等通過(guò)的同時(shí)阻止蛋白和多肽等大分子物質(zhì)通過(guò)。因此，在過(guò)去的幾十年中，許多科學(xué)家致力于口服納米載體的研究。殼聚糖及其衍生物因具有黏膜黏附力、可逆地打開緊密連接及帶有正電荷的特性，已被作為安全有效的腸道吸收促進(jìn)劑。腸道主要通過(guò)跨細(xì)胞或細(xì)胞旁途徑吸收物質(zhì)，而殼聚糖可促進(jìn)跨細(xì)胞及細(xì)胞旁途徑的吸收。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；腸道上皮細(xì)胞；吸收機(jī)制；緊密連接；通透性

由于胃酸的破壞、消化酶的降解以及難以跨越生物膜的機(jī)械屏障作用，蛋白多肽類藥物只能以靜脈、皮下注射等形式給藥，且往往需要長(zhǎng)期反復(fù)給藥，為患者帶來(lái)極大的不便，因此開發(fā)蛋白多肽類藥物口服給藥系統(tǒng)意義重大。雖然各種載體的應(yīng)用已經(jīng)大大提高了蛋白質(zhì)類藥物在胃腸道的吸收能力，但由于各種載體均有其自身局限性，至今仍沒有蛋白質(zhì)的口服制劑上市。為了解決蛋白質(zhì)類藥物的口服胃腸道吸收問題，需要對(duì)胃腸道生理結(jié)構(gòu)和吸收機(jī)制進(jìn)一步認(rèn)識(shí)?，F(xiàn)以殼聚糖為例，對(duì)腸道上皮細(xì)胞的吸收機(jī)制進(jìn)行綜述，為研發(fā)出更好的載體提供理論依據(jù)。本研究對(duì)殼聚糖促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞吸收的機(jī)制進(jìn)行綜述。

1吸收途徑

大分子物質(zhì)在腸道的吸收主要通過(guò)跨膜運(yùn)輸或者細(xì)胞旁途徑?？漳c、回腸的緊密連接相對(duì)疏松及跨膜電阻相對(duì)較低，并且小腸絨毛使得其吸收面積明顯擴(kuò)大，因此藥物在腸道的吸收主要在小腸遠(yuǎn)端，即空腸和回腸。而腸上皮細(xì)胞層是大分子物質(zhì)從腸腔吸收進(jìn)入血液循環(huán)的主要屏障。腸上皮細(xì)胞層由腸道上皮細(xì)胞、M細(xì)胞和杯狀細(xì)胞組成。其中數(shù)量最多的為腸道上皮細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。其次為杯狀細(xì)胞，它可以分泌黏液，防止病原體的入侵。 數(shù)量最少的為M細(xì)胞，主要存在于小腸的遠(yuǎn)端，回腸的派氏結(jié)，它能夠從腸腔攝取抗原和微生物，然后提供給潛在的黏膜免疫系統(tǒng)。隨著時(shí)間的進(jìn)展，上皮細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)逐漸細(xì)化，并且明確了緊密連接是細(xì)胞旁吸收的主要屏障。

1.1跨膜運(yùn)輸物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸方式主要有3種：被動(dòng)運(yùn)輸、主動(dòng)運(yùn)輸、胞吞和胞吐。大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)等進(jìn)行跨膜運(yùn)輸?shù)闹饕绞綖榘毯桶?。腸道對(duì)納米藥物的攝取可通過(guò)胞吞作用，該過(guò)程和抗原的攝取相似。蛋白或多肽等大分子物質(zhì)口服給藥易被胃腸道蛋白酶降解。因此，為了提高口服吸收率及生物利用度，許多載體產(chǎn)生了。通過(guò)采用納米粒子的理化性質(zhì)，如粒徑、黏膜黏附能力、大分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)得以增強(qiáng)。并且，納米粒子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和粒子大小相關(guān)，隨著離子直徑的減小，納米粒子的跨膜運(yùn)輸增強(qiáng)。粒子直徑<100 nm可能被腸上皮細(xì)胞吸收，而>500 nm可能被回腸派氏結(jié)的M細(xì)胞攝取。

1.2細(xì)胞旁途徑脂溶性藥物可通過(guò)跨膜途徑吸收，而一些大分子親水藥物(如多肽、蛋白質(zhì)類藥物)不能夠通過(guò)細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，因此細(xì)胞旁途徑成為其吸收的主要途徑。細(xì)胞旁途徑的吸收(即通過(guò)上皮細(xì)胞間的間隙)受緊密連接制約。緊密連接在機(jī)體中起著機(jī)械性連接、支持和封固作用,使細(xì)胞間聯(lián)系加強(qiáng),避免受外力的作用而彼此分離。緊密連接一般圍繞著上皮細(xì)胞的頂端,呈連續(xù)的腰帶狀分布,與管腔之間形成一個(gè)滲透屏障,從而阻止管腔內(nèi)的物質(zhì)與細(xì)胞間隙內(nèi)物質(zhì)的任意互流,使兩者均可維持一定的濃度梯度。緊密連接形成一道屏障，允許從腸腔中吸收所需的水和電解質(zhì)，防止炎癥和感染因子等進(jìn)入全身循環(huán)，對(duì)于維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)有著重要的意義[1]。緊密連接是物質(zhì)吸收的主要屏障，并且有研究表明，缺乏緊密連接的細(xì)胞層基本無(wú)屏障功能[2]。緊密連接蛋白claudins(CLDNs)可以分為3類：完整的跨膜蛋白、周邊相關(guān)的胞質(zhì)蛋白和信號(hào)蛋白[3]?？缒さ鞍装–LDNs、閉鎖蛋白、連接黏附分子，胞質(zhì)蛋白主要包括閉鎖小帶蛋白(zona-occluden，ZO)。信號(hào)蛋白起著黏附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，但對(duì)上皮細(xì)胞的通透性無(wú)影響[4-5]。 迄今為止，CLDNs家族有27種[6]，主要決定細(xì)胞旁途徑吸收的組織、大小、電荷選擇性。并且，生理學(xué)的證據(jù)表明CLDNs對(duì)緊密連接的屏障功能起決定性作用[7]。一些實(shí)驗(yàn)證明，CLDN-7主要形成緊密連接鏈[8]；CLDN-1，-3,-4,-5,-8,-11,-14，-19和細(xì)胞旁緊密連接的強(qiáng)度有關(guān)[9]。CLDN-4,-8,-14為陽(yáng)離子屏障，而CLDN-2,-7,-10,-13,-15,-16為陽(yáng)離子和陰離子屏障[2]。值得注意的是，敲除超過(guò)90%的ZO-1和ZO-2并不導(dǎo)致緊密連接的斷裂[10]，表明只有一少部分的ZO蛋白參與了緊密連接的構(gòu)成。并且，有研究表明，缺乏ZO-1蛋白，緊密連接不能形成[11]，提示ZO-1蛋白是形成緊密連接的必需部分。

最近的研究已經(jīng)闡明殼聚糖可以可逆地打開Caco-2細(xì)胞間的緊密連接，從而促進(jìn)藥物的吸收[12]。Sonaje等[13]通過(guò)鑭(電子致密示蹤劑)染色展現(xiàn)了殼聚糖對(duì)緊密連接的開放。在實(shí)驗(yàn)組，可在緊密連接之間及基底側(cè)觀察到鑭，而在對(duì)照組，主要在微絨毛表面觀察到鑭，表明沒有緊密連接開放。以上的結(jié)果表明，具有黏膜黏附功能的殼聚糖具有打開緊密連接的能力。

從理論上講，納米顆粒的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)是不可行的，因?yàn)樯掀ぜ?xì)胞間的間隙在天然狀態(tài)下為0.3~1 nm，這阻礙了大多數(shù)納米粒子的滲透。即便在緊密連接完全打開的狀態(tài)，細(xì)胞間的間隙最大只有20 nm，這限制了完整的殼聚糖納米粒的細(xì)胞旁途徑轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，大分子物質(zhì)的細(xì)胞旁途徑的運(yùn)輸有賴于殼聚糖納米粒的裂解[14]?？赡艿臋C(jī)制為：殼聚糖納米粒能夠黏附和滲透黏液；滲透的納米粒變得不穩(wěn)定且使附近的上皮細(xì)胞表面松解，并促進(jìn)其加載的藥物釋放。然后，由于殼聚糖介導(dǎo)，上皮細(xì)胞間的緊密連接已打開，其負(fù)載的藥物可進(jìn)入血液循環(huán)。

2促進(jìn)吸收的機(jī)制

2.1電荷依賴性生理狀態(tài)下，腸腔的pH為弱堿性，因此帶有正電荷的物質(zhì)易被腸道吸收。殼聚糖、多賴氨酸、聚乙烯亞胺等帶有正電荷的物質(zhì)可以使腸道上皮細(xì)胞模型的緊密連接打開，并且該過(guò)程是可逆的。但是，納米粒表面電荷對(duì)其吸收是否有影響仍有爭(zhēng)議。研究表明，和中性或帶有正電荷的納米粒相比，帶有負(fù)電荷的納米粒與腸道上皮細(xì)胞的親和力低[15]；而Shakweh等[16]發(fā)現(xiàn)的結(jié)果恰恰相反。

2.2增加黏膜黏附性增加納米粒的黏膜黏附能力是增加腸上皮細(xì)胞吸收率的有效方法。殼聚糖是一個(gè)眾所周知的黏膜黏附性聚合物，其黏附性是由于帶正電荷的殼聚糖和黏膜表面的帶負(fù)電荷的唾液酸殘基之間的靜電作用。這種相互作用可以延長(zhǎng)殼聚糖納米粒同其黏附面的接觸時(shí)間，從而促進(jìn)其口服吸收能力。并且，殼聚糖使得藥物在胃腸道的滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，這種黏附特性可促進(jìn)跨細(xì)胞及細(xì)胞旁途徑的吸收。

2.3緊密連接的打開

2.3.1緊密連接相關(guān)蛋白的改變CLDNs同緊密連接的打開密切相關(guān)。經(jīng)殼聚糖處理后，CLDN-4從胞膜到胞質(zhì)重新分布，接著緊密連接的強(qiáng)度降低，最終使得細(xì)胞旁途徑的通透性增加[12]。并且，CLDN-1在緊密連接中高表達(dá)可使得細(xì)胞旁電阻降低，進(jìn)而增加上皮細(xì)胞通透性[17]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖及其衍生物可誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白骨架重組[18]的同時(shí)，肌動(dòng)蛋白的其他形態(tài)學(xué)沒有改變。此外，閉鎖蛋白、ZO-1蛋白也可能發(fā)生了改變。但是，一項(xiàng)關(guān)于HT-29/B6細(xì)胞模型的研究表明[19]，與Caco-2細(xì)胞模型不同，殼聚糖作用于HT-29/B6細(xì)胞模型后，大分子物質(zhì)細(xì)胞旁通透性的增加與CLDNs和ZO-1的表達(dá)、肌動(dòng)蛋白骨架的形態(tài)學(xué)改變無(wú)關(guān)。隨著細(xì)胞旁電阻的降低，細(xì)胞旁通透性增加，但是具體機(jī)制尚不明確。

2.3.2蛋白激酶C(protein kinase C,CPK)激活目前，已發(fā)現(xiàn)的PKC亞型至少有10種[20]。通常情況下，PKC參與了緊密連接的打開或裂解，因此PKC的抑制會(huì)阻礙膜電阻的降低[21]。而殼聚糖激活了依賴PKC的信號(hào)通路，進(jìn)而影響緊密連接的完整性，從而促進(jìn)細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)。但是也有研究表明，PKC亞型不同，對(duì)上皮細(xì)胞的通透性可能不同，有的甚至相反[22]。

2.4降低電阻物質(zhì)通過(guò)跨細(xì)胞途徑吸收需要克服跨膜電阻的作用。研究表明，殼聚糖納米?？纱龠M(jìn)腸道的跨膜吸收[23-24]。并且，納米藥物促進(jìn)跨膜運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制是降低腸上皮細(xì)胞的跨膜電阻[18-19]。

3毒性研究

在增加腸上皮細(xì)胞通透性的同時(shí)，是否會(huì)增加小腸內(nèi)毒素的吸收，目前仍是一個(gè)有爭(zhēng)議的問題。已有研究表明了殼聚糖納米粒對(duì)脂多糖(胃腸道最常見的毒素)吸收的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[14]，負(fù)載胰島素的殼聚糖納米粒可通過(guò)上皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，但脂質(zhì)體卻不能透過(guò)，是因?yàn)殛庪x子脂質(zhì)體和帶負(fù)電荷的黏液層之間的電荷斥力。在體內(nèi)的毒性研究進(jìn)一步證實(shí)了殼聚糖細(xì)胞旁滲透的提高不增加脂多糖吸收。因此，殼聚糖納米粒子作為口服給藥載體前景可觀。另一項(xiàng)研究表明[19]，殼聚糖的毒性與其濃度相關(guān)，在聚合物濃度為0.005%時(shí)，其降低跨膜電阻的力度最強(qiáng)且無(wú)毒，濃度<0.001%時(shí)，不具備降低跨膜電阻的能力，而濃度為0.01%時(shí)則具有細(xì)胞毒性。

4結(jié)語(yǔ)

腸道上皮細(xì)胞即是藥物吸收的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是藥物吸收的主要屏障。大分子物質(zhì)(如蛋白及多肽)主要通過(guò)跨細(xì)胞或細(xì)胞旁途徑吸收。增強(qiáng)跨膜運(yùn)輸主要通過(guò)降低跨膜電阻、增加黏膜黏附能力等途徑。而增強(qiáng)細(xì)胞旁途徑的運(yùn)輸主要通過(guò)緊密連接的打開。緊密連接的打開主要與CLDNs、閉鎖蛋白、ZO蛋白的結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)的改變以及PKC的激活有關(guān)。通過(guò)對(duì)這些機(jī)制的了解，可以研制出相應(yīng)的載體，更好地實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放。目前緊密連接的結(jié)構(gòu)尚未能完全闡明，緊密連接的打開機(jī)制尚未完全明確，需要更為深入的研究。

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Mechanisms of Chitosan Enhancing Intestinal Epithelium AbsorptionSUNLu-yin，YANCai-feng.(DepartmentofEndocrinology，NorthernJiangsuPeople′sHospital,Yangzhou225001，China)

Abstract:Peptides and proteins featured with high efficiency,low toxicity and small drug interactions,are more and more applied in clinical practice.The gastrointestinal epithelium,forms the boundary between the body and external environment,effectively provides a selective permeable barrier that limits the permeation of peptide and protein,while allowing the appropriate absorption of nutrients and water.Over the past decades,many researchers have developed various nanoparticles for oral delivery systems.Chitosan (CS),a cationic polysaccharide,is widely regarded as a safe and efficient intestinal absorption enhancer of therapeutic macromolecules,owing to its inherent mucoadhesive feature and ability to modulate the integrity of epithelial tight junctions reversibly.The epithelial cells create this selective permeability by two pathways:the transcellular and the paracellular route.As an efficient absorption enhancer and drug carrier,CS increases both transcellular and paracellular transports of macromolecules across the intestinal epithelium.

Key words:Chitosan; Intestinal epithelium; Absorption mechanism; Tight junction; Permeability

收稿日期：2014-12-01修回日期：2015-03-13編輯：薛惠文

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.20.015

中圖分類號(hào)：R58；R944

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)20-3686-03